斑马鱼早期胚胎背腹发育中ripply1的作用(2)

　　胚胎用洗液 I（ 50% 甲酰胺，2 × SSC,0. 1% Tween-20） 洗 30 min（ 60℃ ） ,重复 1 次； 用洗液 II （ 5% 甲酰胺，0. 2 × SSC,0. 1%Tween-20） 洗15 min（ 60℃） ,重复 1 次； 用洗液 III （ 0. 5% 甲酰胺，0. 02 × SSC,0. 1% Tween-20） 洗 30 min（ 60℃ ） ,重复 1 次。然后用 MABT 在室温下洗3 次，用封闭液封闭4 h.偶联碱性磷酸酶的地高辛抗体 1∶ 2500 稀释于封闭液中，4℃ 孵育过夜。第 3 天吸出抗体以重复使用，用MABT 在室温下洗 30 min,重复 1 次； 用 PBST 在室温下洗 30 min,重复 1 次； 在平衡缓冲液（ 0. 1 mol/LNaCl,0. 1 mol / L Tris-HCl pH 9. 5,0. 05 mol / L MgCl2,0. 1% Tween-20） 中平衡 10 min,加显色液（ 5 mL 平衡缓冲液中加100 μL 60 mg/mL 左旋咪唑，100 μLNBT / BCIP） ,室温避光，待信号足够强加多聚甲醛终止反应，在70%酒精中脱去浮色，拍照观察。

　　1. 2. 3 显微注射 ripply1 mRNA显微注射方法详见早期工作[5].ripply1 mRNA注射剂量为每个胚胎 200 pg.

　　1. 2. 4 ripply1 启动子序列及转基因鱼的获得从基因组中调取 ripply1 基因组上游约 1. 2 kb的片段，引物如下： promoter-F: 5'-ATTCTCGAGG-GATCCAAAACAGCTTAT-3',promoter-R: 5 '-ATTA-GATCTGAATGAATGAAGGCGCGT-3'.并且在上下游引物中分别引入 Xho I 和 Bgl II 酶切位点，双酶后切连入 pT2A200R150G 载体。

　　单独注射该质粒观察胚胎是否有荧光。有荧光后将该质粒和转座酶 mRNA 共注射，剂量均为 50pg,待该批注射的斑马鱼 F0 代性成熟后外交，筛选后代胚胎有特异荧光的 F1 代。
　　
　　2 结果

　　2. 1 整胚原位杂交揭示 ripply1 在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达模式为了明确 ripply1 是否参与早期背 - 腹轴的形成，我们首先利用整胚原位杂交检测该基因的时空表达图式。结果显示 ripply1 母源表达，但表达水平低。在原肠作用早期即胚环期表达增强且集中在预定背部的胚盾位置，在胚盾期 ripply1 在背部的表达继续增强，并且向侧部延伸。在原肠期，随着细胞运动的进行，ripply1 主要表达在前脊索板中胚层和后部将要形成的体节中，但在脊索中胚层中没有表达（ 图 1） .这个表达图式暗示 ripply1 基因可能在背- 腹轴和前 - 后轴形成过程中起调节作用。

　　2. 2 高表达 ripply1 导致胚胎背部化

　　我们下一步对 ripply1 在背 - 腹轴形成中的作用进行了功能检测。在胚胎 1 细胞期通过注射 rip-ply1 mRNA 进行高表达，收集胚盾时期的胚胎进行原位杂交。分别检测背部标记基因 gsc、chd、flh 和腹部标记基因 eve1、tbx6、wnt8a 的表达。我们发现几乎所有 ripply1 注射的胚胎背部标记基因 gsc、chd、flh 表达不但在背部增强并且明显向腹侧扩增。

　　相反，腹部标记基因 eve1、tbx6、wnt8a 表达明显减弱（ 图 2） .这个结果说明高表达 Ripply1 改变了背腹细胞的命运，使背部区域扩大。显示 ripply1 能调节斑马鱼背部的发育。在 10 hpf（ 胚芽期） 时观察胚胎的表型，发现原本呈球形的胚胎前后伸长，呈现明显的椭球形，这是典型的背部化表型（ 图 3A,B） .24 hpf 后观察胚胎，大多数胚胎（ 82/99） 表现出背部化，其中 36 枚胚胎头部增大，尾部缺失（ 图 3C,D） ,而 46 枚胚胎头部明显增大，体轴变短，尾部变短，无腹部尾鳍（ 图 3E） ,一小部分胚胎（ 6/99） 甚至呈现双体轴（ 结果未显示） .这些表型进一步说明 ripply1 通过抑制胚胎后部发育来促进前部的发育。
　　
　　2. 3 ripply1 启动子及转基因斑马鱼

　　为了研究 ripply1 时空表达的调节机制，我们开展了对其启动子的研究。获得 ripply1 转录起始位点上游 1. 2kb 的片段后，将其后加 EGFP,然后克隆到 pT2A200R150G 转基因载体上（ 图4A,B） .质粒注射后发现在胚盾期在胚盾处有特异的荧光表达（ 图 4C,D） ,体节期在体节处有特异的表达（ 结果未显示） ,说明该 1. 2 kb 的片段能够调控 ripply1 在斑马鱼胚胎中时空特异的表达。与转座酶共注获得转基因鱼 ripply1: EGFP 的 F0 代，发现其子代在 1细胞期即有荧光，直到胚盾期仍是泛表达（ 图 5A-C‘） ,可能是由于 EGFP 比较稳定，而母源的 ripply1比较容易降解。在体节期该荧光则特异定位在躯干（ 图 5D,D’） .在 24 hpf,EGFP 信号主要集中在体节中（ 图 5E） ,而在成鱼中，EGFP 信号主要集中在整个躯干部分（ 图 5F-G‘） .