正向遗传筛选斑马鱼肝脏、肠和胆囊发育缺陷突变体

　　肝脏、胆囊、肠等是重要的消化器官，在食物消化、贮存、营养吸收、排泄和内分泌等方面都有着重要的作用[1].斑马鱼是常用的脊椎模式动物，它的消化器官组成结构和发育分子机制类似于哺乳动物[2].斑马鱼具有体外发育、胚胎透明、胚胎发育周期短、产卵量大等优点，突显其在遗传学研究上的优势，也使得斑马鱼成为目前唯一适合于大规模遗传筛选的脊椎模式动物[3].构建斑马鱼消化器官发育缺陷突变体有助于研究消化器官发育的分子机制，并可能用于人类相关先天性疾病的研究。本课题通过在斑马鱼中进行无基因差别的正向遗传筛选，获得不同消化器官发育缺陷的突变体，为后续消化器官发育分子机制的研究奠定基础。
　　
　　1 材料与方法

　　1. 1 材料
　　
　　1. 1. 1 实验动物1突变体遗传诱变及传代。

　　1. 1. 2 实验试剂多聚甲醛、氯化钾、磷酸氢二钠、氯化钠、磷酸二氢钾、柠檬酸钠、氯化镁、柠檬酸、去离子甲酰胺（ 上海生工生物工程股份有限公司） ; PTU （ 1-phenyl-2-thiourea ） 、 ENU （ N-ethyl-N-nitrosourea ） 、 Tris（ pH 9. 5） 、蛋白酶 K、BSA、NBT（ nitrotetrazolium bluechloride ） 、BCIP （ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phos-phate） 、肝素、tRNA（ Sigma） ; BES-H2O2-Ac 过氧化氢荧光染料（ 日本和光纯药工业株式会社） .

　　1. 1. 3 实验器材斑马鱼养殖系统（ 北京爱生科技发展有限公司） ; 荧 光 体 视 显 微 镜 （ Zeiss SteREO DiscoveryV20 ） ; 全自动荧光正置显微镜 （ Zeiss AxiolmageZ2） ; 移液器（ Gilson 10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 mL） ; 恒温培养箱（ MemmentINE800） ; 盘旋混合仪（ 江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司 KB-3-D） ;分子杂交箱（ UVP HL-2000 hybrilinker hybridizationOven / UV cross linker） ; pH 计及精密电子天平（ Mett-ler Toledo） ; 圆周式摇床（ GFL 3005 型） ; 24 孔细胞培养皿（ Costar） .

　　1. 2 方法
　　
　　1. 2. 1 胚胎收集及处理斑马鱼交配产生的受精卵收集于 0. 03% 的海盐水中，并于 28℃恒温箱饲养。胚胎的发育阶段依据已有报道确定[4].在胚胎 12 hpf（ hours post-ferti-lization） 起用 0. 03% PTU 处理抑制色素形成，并在3. 5 dpf（ days post-fertilization） 和 5dpf 时收集用于实验的胚胎。

　　1. 2. 2 全胚胎原位杂交（ whole-mount in situ hybrid-ization,WISH）lfabp 探针合成与全胚胎原位杂交实验依据已有报道进行[5].3. 5 dpf 胚胎用蛋白酶 K（ 1: 1000稀释） 在 37℃ 消化 26 min.反义 RNA 探针用地高辛标记。NBT/BCIP 显色时，室温闭光 0. 5 ~ 1 h 即有明显信号。

　　1. 2. 3 BES-H2O2-Ac（ DCFH-DA） 荧光染色BES-H2O2-Ac（ DCFH-DA） 可用 于检测生理过程中产生的细胞源性活性氧分子（ reactive oxygenspecies,ROS） 如 O2-,H2O2,HO·等，斑马鱼胚胎发育过程中肠和胆囊可产生 H2O2,可被 BES-H2O2-Ac（ DCFH-DA） 标记[6].收集的 5 dpf 斑马鱼胚胎放入24 孔细胞培养盒中，并换上新的 0. 03% 的海盐水。

　　每孔之中加入 1 μL BES-H2O2-Ac 荧光染料（ 1mg /L,溶于 DMSO） ,使稀释度约为 1∶ 10 000,轻轻晃动，使染液迅速分散开，然后将培养盒放入 28℃恒温箱中 1 ~2 h 后取出，在荧光显微镜下观察肠和胆囊的形态发育状况。