正向遗传筛选斑马鱼肝脏、肠和胆囊发育缺陷突变体(2)

　　1. 2. 4 筛选过程及表型分类用 ENU 处理野生成年雄性斑马鱼若干，存活的雄鱼称为 F0,与野生型杂交产生 F1 代。F2 家族由来自不同 F0 的 F1 鱼交配产生。将来自同一 F2 家族的斑马鱼随机交配以获取 F3 子代，利用 1. 2. 2 及1. 2. 3 中所述方法进行实验，若 F3 子代中 1 /4 左右的个体表现出相同的缺陷表型，则其 F2 父母可被认定为携带隐性突变的杂合突变体。将 F2 杂合突变体与野生型杂交传代，产生的后代称为 F3,以同样的方法利用 F4 胚胎来确定 F3 杂合突变体。最终确定的 F3 突变体，将会依据其表型特征被分为几种不同的类别[7].

　　2 结果

　　2. 1 ENU 诱变与 F2 家族的建立用 ENU 处理 30 条约 6 月龄期健康雄鱼，9 条F0 存活，将 F0 与野生型雌鱼杂交产生子代，即 F1代（ 每条 F1 代表一个突变基因组） ,保留 F0 第二次与第三次交配产生的子代饲养至成鱼，可保证 F1携带较多突变，并降低来自于同一精母细胞带有相同突变的精子都产生子代的概率，每条 F0 生产约100 条 F1,共计 958 条，然后将不同 F0 产生的 F1 交配产生 F2 家族。

　　2. 2 F2 代筛选与突变体的传代将来自同一 F2 家族的鱼随机交配，检测产生的F3 胚胎的表型，并根据孟德尔遗传定律判断亲本是否为候选突变体。我们从 64 个 F2 家族中的 204 对鱼中，筛选得到了65 对候选突变体，并对表型不确定的候选突变体做了二次鉴定，排除了 12 对非突变体。有4 对因表型非特异性被舍弃，另有 9 对在筛选中丢失或死亡而无法鉴定。最终，来自23 个 F2 家族的32对突变体与野生型进行传代，产生了 F3 家族，见表1.因为 F2 家族是由不同的 F1 相互杂交产生的，所以每个 F2 家族突变体代表两个突变基因组，故此次筛选的规模为128 个突变基因组。

　　2. 3 F3 代建立与筛选F3 代家族筛选与 F2 代筛选类似，将来自同一 F3家族的斑马鱼雌雄个体之间随机交配以产生 F4 胚胎，根据 F4 胚胎表型比例确定 F3 是否为杂合突变体。在总共32 个 F3 家族中，其中有一个家族（ L39-4） 因全是雌鱼无法配对而被舍弃。其余 31 个 F3 家族共成功交配 251 对斑马鱼，从中筛选得到了 40 对突变体。二次鉴定之后，18 个 F3 家族的表型是可遗传的。最终，依据表型、初始 F2 家族，保留下来的 34对突变体归为23 个 F3 突变品系，见表2.

　　2. 4 F3 突变体的表型分类F3 筛选结束之后，根据突变品系的不同表型特征，将其分为六类，见表 3 和表 4,代表品系展示见图 1.第 I 类为“肠特异性缺陷突变体”,这类突变体的肠具有较大程度缺陷，基本表现为肠弯曲窄细或者几乎无染料荧光，但是肝脏和胆囊都较为正常。

　　第 II 类为“肝脏特异性缺陷突变体”,其肠和胆囊较为正常，而肝脏缺陷较为严重，通常表现为无肝脏和肝脏偏小的表型。第 III 类为“胆囊特异性缺陷突变体”,其肝脏和肠并无明显缺陷，但是胆囊呈现出偏小或者缺失的性状。第 IV 类为“肠和胆囊共同缺陷突变体”,该类突变体中肝脏并没有出现发育缺陷但是肠、胆囊染色均出现了缺陷表型。第 V 类为“肝脏和胆囊共同缺陷突变体”,其肝脏和胆囊都出现了发育缺陷但是肠染色却是正常的，通常表现为肝脏偏小和胆囊偏小的表型。第 VI 类为“肝脏、肠和胆囊共同缺陷突变体”,lfabp 和 BES-H2O2-Ac 染色结果都显示肝脏、肠和胆囊存在明显的发育缺陷。
　　
　　3 讨论

　　3. 1 遗传筛选的结果分析虽然正向遗传筛选斑马鱼发育缺陷突变体的研究已广泛开展，但是利用 ENU 诱变同时筛选多个消化器官发育缺陷突变体的案例却并不多。本次筛选工作着重关注肝脏、胆囊以及肠 3 个消化器官的发育缺陷，在一次筛选中获得多种突变体，提高了突变群体的利用率，并可获得单个消化器官特异性缺陷的突变体。ENU 筛选过程中的突变效率一般为 0. 2% 左右[8],本次研究中并没有检测突变效率，但是在 128个突变基因组的筛选中，最终获得了突变品系 23个，可见本次突变和筛选的效率都是比较高。这些突变体表型多样化，说明调控不同消化器官发育的基因是不同的，但也发现不同突变体表型之间有交叉。从 23 个突变品系分类来看，有约 40% 的突变品系具有 2 种及以上的发育缺陷表型。说明这些消化器官在各自发育过程中的某些调控因子之间存在相似性，也暗示了它们在分子发育调控过程中存在着必然的联系。

　　3. 2 筛选过程中存在的不足和限制性因素ENU 筛选工作量大，空间和人手都是限制性因素。此次筛选规模并不大，为了弥补这一缺陷，我们采用 F1 代雌雄个体进行交配而非传统的 F1 外交生产 F2 家族的策略，提高了筛选效率，但也导致了突变体的遗传背景更为杂乱，获得的突变体需外交传代稀释遗传背景。

　　我们的筛选获得了 23 个突变品系，将利用图位克隆技术鉴定突变基因，并针对突变体表型和突变基因进一步探究，有望对斑马鱼乃至其他脊椎动物消化器官发育的分子机制有进一步的理解。