胎膜早破是造成早产的重要因素,早产中约有三分之一并发胎膜早破。发展中国家早产儿死亡率仍较发达国家明显升高,降低早产胎膜早破至关重要。很多微生物常与早产及胎膜早破同时存在,故孕期检测与胎膜早破相关的微生物,早期发现、早期预防及早期治疗,可能减少早产胎膜早破的发生,提高新生儿生存质量。本文选取≤孕34周的早产胎膜早破(PPROM)病例37例,对宫颈分泌物支原体培养及母血病毒基因检测结果进行分析。
1、资料与方法
1.1一般资料选取2011年6月-2012年6月在本院住院的PPROM孕妇37例,年龄15岁~43岁,平均28岁±6.9岁;孕周29+2周~34周,其中<32周16例;初产妇21例,经产妇16例。随机选取足月胎膜未破孕妇30例作为对照组,年龄18岁~36岁,平均(25±4.5)岁;孕周37周~41+5周,初产妇14例,经产妇16例。两组年龄、孕次及产次比较无统计学意义,排除羊水过多、双胎、宫颈机能不全、羊水穿刺及激烈运动等因素。
1.2方法
1.2.1支原体培养常规消毒外阴,用阴道窥器暴露阴道及宫颈,将无菌棉拭子放入宫颈管内或宫口内侧缘旋转2圈~3圈后停留5s~10s,放入无菌试管密封送检。将宫颈分泌物接种在支原体培养试剂盒中,置36℃的5%CO2培养箱中培养24h~48h后观察结果。试剂盒由梅里埃诊断产品(上海)有限公司生产。
1.2.2病毒基因检测设计引物并制作基因芯片,取母血标本,采用液态悬浮式基因芯片法检测血清病毒基因水平。包括甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒,单纯疱疹病毒、风疹病毒、人巨细胞病毒、麻疹病毒、人乳头瘤病毒、柯萨奇病毒B、流行性腮腺炎病毒。仪器为德国Biometra公司生产的热循环仪(PCR仪),型号TprofessionalThermocycler。试剂:RT-PCR采用上海Promega公司的RT-PCRKitCatalog;PCR采用TaKaRa公司的TaKaRaTaqTM。
1.3统计学方法应用SPSS19.0软件对数据统计学分析,采用χ2检验、Fisher确切概率检验,P<0.05具有统计学意义。
2、结果
2.1早产胎膜早破组与对照组支原体培养阳性率比较≤孕34周PPROM组宫颈分泌物支原体培养阳性12例(32.43%),对照组3例,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。而<32周组与32周~34周组支原体与病毒阳性率比较均差异无统计学意义(P>0.05)。PPROM组支原体与病毒共同阳性6例(16.22%),对照组2例(6.67%),PPROM组高于对照组,但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。
2.2早产胎膜早破组病毒检测阳性结果分析≤孕34周的早产胎膜早破组检出乙型肝炎病毒(HBV)11例,单纯疱疹病毒Ⅱ型7例、风疹病毒6例、人巨细胞病毒5例,未检出其它病毒。对照组仅检出HBV12例,余种病毒均未检出。PPROM组非HBV病毒阳性18例,与对照组比较有统计学意义(Fisher检验,χ2=19.956,P=0.000)。PPROM组中5例检测出2种病毒,2例检测出3种病毒,且均包括HBV。PPROM组HBV阳性率(11/37,29.73%)与对照组(12/30,40%)比较无统计学意义(P>0.05)(表2)。
3、讨论
胎膜早破是产科常见并发症,是造成早产的重要因素。发生在37周之前称为早产胎膜早破,分为3种:(1)无法存活之胎膜早破(<23周);(2)远离足月之胎膜早破(存活~32周);(3)近足月之胎膜早破(约32~36周)。胎膜早破会导致胎儿发育不良,出生质量降低。早产胎膜早破的主要危害是宫腔感染、胎儿窘迫、脐带脱垂、呼吸窘迫综合征等,主要发生在远离足月之胎膜早破者,而近足月之早产胎膜早破者很少发生。≥34周胎儿发育均趋成熟,34孕周以上新生儿的生存率和患病率与足月新生儿相近,所以对孕34周前的早产胎膜早破应予足够的重视。
胎膜早破往往是多种因素作用的结果,在所有发生胎膜早破的因素中,已证实细菌性感染是其最重要的原因。目前已知的微生物有梅毒螺旋体、淋病双球菌、β族链球菌、解脲支原体、人支原体、衣原体、阴道毛滴虫、类杆菌等,病毒感染少见。
生殖道支原体感染是目前医学界争议颇多的问题。目前大量的研究结果表明,支原体感染可能是胎膜早破的一个重要因素。也有报道显示支原体在某些人群当中可能属于正常菌群,但更有证据证明支原体感染与生殖道感染相关。孕妇生殖道支原体感染后所诱发的炎症反应可产生多种胶质酶和弹性蛋白酶,这些酶类均可降解胎膜的基质和胶质,从而诱发胎膜早破。此外支原体感染的同时,也可增加其他病原微生物感染的几率。这些混合感染可减少宫颈IgA及IgG活性,使黏蛋白酶活性增加,黏液量减少,加剧了胎膜早破的发生。本实验中≤孕34周PPROM组宫颈分泌物支原体培养阳性率32.43%,与对照组比较有统计学意义,故仍不能忽视支原体感染对胎膜早破的影响。另外PPROM组支原体与病毒共同阳性6例(16.22%),对照组2例,PPROM组高于对照组,两组比较无统计学意义,考虑样本数量较少,增加样本量可能得到有意义的结果。但该结果仍提示支原体与病毒感染可能互相影响,即一种病原体感染可能影响机体的防御机制,而引起与其它病原体混合感染,因此应重视病原体的早期检查,早期治疗。
病毒感染因多数为潜伏感染,与PROM关系研究较少。病毒感染通过两种途径诱导宿主细胞凋亡:经免疫系统介导或病毒本身具有凋亡调节基因。有些为抑制细胞凋亡的病毒,但其造成持续性感染以及潜伏感染,可导致机体长期带毒而无明显的临床症状,且可通过诱导产生细胞凋亡分子而促进细胞凋亡。
从而使胎膜组织破坏,最终导致胎膜脆性增高,形成胎膜早破。
在绒毛膜细胞和胎膜细胞的研究中,日本东京大学的Uchide等发现流感病毒在体外感染绒毛膜细胞和胎膜细胞后,能诱导诱导产生一系列的细胞因子,如IL-1β、IL-6、IFN-α、TNF,并能诱导绒毛膜细胞和胎膜产生单核分化诱导因子促进单核细胞向巨噬细胞分化,产生相关的超氧负离子,进一步诱导细胞凋亡。Caspase3广泛分布于各种不同类型的细胞中,是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一。近年Saglam等研究发现早产胎膜早破患者胎膜中活化caspase-3表达明显高于足月对照组,早产胎膜未破患者胎膜中活化caspase-3表达亦高于对照组,虽无统计学意义,但仍能说明早产胎膜早破确实与胎膜组织细胞凋亡有关。但也有研究发现单纯疱疹病毒Ⅱ型感染孕妇胎膜早破发生率与对照组比较,无统计学意义。
基因诊断技术已用于宫内感染的研究,这对解决潜伏性病毒感染的诊断起到了重要作用。Gervasi等人对729例中期妊娠孕妇行羊膜腔穿刺,通过实时定量PCR技术检测羊水样本,发现存在目标病毒基因者仅16例,占2.2%,其中人类疱疹病毒6型(HHV6)7例,巨细胞病毒6例,B19病毒2例,EB病毒1例;7例HHV6阳性病例中母血中相关病毒DNA检测阳性6例,脐血检测1例阳性,而其它羊水检测病毒阳性及阴性病例母血及脐血检测病毒基因均为阴性。Naresh等人认为虽然早产胎膜早破和早产与宫内感染密切相关,他们对13例PPROM孕妇行羊膜腔穿刺术,通过PCR技术检测多种病毒,结果均未检出病毒。由此可见,羊水检测病毒基因阳性例数较少,母血及脐血检测病毒基因亦较难获得病毒感染的依据。且羊膜腔穿刺术为侵袭性操作,因存在术后流产、阴道出血及继发感染等并发症而不易接受,多用于胎儿染色体的检查。
目前已分别有诊断多种细菌和病毒的基因芯片问世,从形态上可分为两大类:固态的片式基因芯片与液态的悬浮式基因芯片。液态悬浮式基因芯片检测灵敏度高,信号准确,应用前景广阔。本研究研发一种悬浮式宫内感染病原体筛查基因芯片,应用液态悬浮式基因芯片方法检测母血中的病毒基因,以研究病毒和早产胎膜早破的关系。≤孕34周的早产胎膜早破组检出乙型肝炎病毒11例,单纯疱疹病毒Ⅱ型7例、风疹病毒6例、巨细胞病毒5例,未检出其它病毒。PPROM组乙肝病毒阳性率与对照组比较无统计学意义,考虑乙肝病毒感染可能不是胎膜早破的直接原因。但PPROM组非HBV病毒阳性18例,对照组未检出其它病毒,两组比较有统计学意义,提示病毒感染可能与胎膜早破密切相关。另外,PPROM组5例检测出2种病毒,2例检测出3种病毒,均包括乙型肝炎病毒,故考虑多种病毒感染可能促进胎膜早破的发生,此结果需扩大样本量进一步研究。
本研究结果提示≤孕34周早产胎膜早破可能与支原体及病毒感染密切相关,故早发现、早治疗生殖道感染可以降低胎膜早破早产发生率。应重视孕前期病原体包括病毒的检测,选择治疗后妊娠,对减少早产胎膜早破,降低围生儿病率及围生儿死亡有重要的临床意义。
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