围生期孕妇B族链球菌感染和耐药性检测对妊娠的影响

　　B 族链球菌 (group B Streptococcus, GBS) 也叫无乳链球菌［1］, 是一种兼性厌氧革兰阳性链球菌 , 属于条件致病菌 ,常寄居阴道及胃肠道 , 也可寄居于婴幼儿上呼吸道 , 临床常通过细菌培养、GBS 核酸检测等进行 GBS 筛检。据相关研究报道［2］, 正常孕妇阴道中 GBS 的检出率为 6.5%~36.0%, 孕妇围产期感染 GBS 是引发胎膜早破、新生儿败血症、新生儿宫腔感染、脑膜炎、肺炎等疾病的重要因素之一 , 有研究证实 , 对 GBS 阳性孕妇采取抗生素治疗 , 对有效降低新生儿感染率、发病率均具有重要意义。本文分析研究围生期孕妇B 族链球菌 (GBS) 感染和耐药性检测对妊娠结局的影响。总结报告如下。

　　1 资料与方法

　　1. 1一般资料　选取 2013 年 2 月 ~2014 年 2 月本院妇产科接诊的 410 例产期孕妇 , 年龄 22~37 岁 , 平均年龄 (28.2±1.6)岁 , 孕期 35~37 周 , 所有产妇均知悉本组研究目的 , 自愿参与本实验并签署知情同意书。

　　1. 2方法
　　
　　1. 2. 1仪器及试剂　① GBS 培养鉴定 ：采用 Todd-Hewrtt肉汤、小牛血清、哥伦比亚血琼脂 ( 英国 OXOID 公司 ), GBS鉴定采用 rapidID32STAEP 鉴定板条 ( 法国生物梅里埃公司 )。② GBS 药敏定量试验：采用 VITEK-2 全自动鉴定药敏仪 ( 法国梅里埃), 质控菌株肺炎链球菌ATCC4961［9中国卫生部(现卫计委 ) 临床检验中心］。③ PCR 检测 ：实时荧光 PCR 仪选用 CFX96 实时荧光定量 PCR 仪 ( 美国 Bio-Rad 公司 ), PCR检测试剂采用B族链球菌核酸检测试剂盒［泰普生物科学(中国 ) 有限公司］。DNA 提取试剂 ( 美国 Qiagen 公司 )。

　　1. 2. 2标本采集　由医师规范采集阴道和直肠拭子标本各2 份。参照美国疾病预防控制中心在《围生期 GBS 预防指南》中推荐的取材方法［3］, 于孕 35~37 周取材 , 不使用阴道窥器 ,清除外阴分泌物后 , 将 2 根无菌阴道棉拭子同时置入阴道内下 1/3 处 , 旋转 1 周 , 采集阴道分泌物 ；将两根棉拭子同时插入肛门 , 于肛门括约肌上 2~3 cm 处轻轻旋转 , 采集直肠分泌物 , 每位孕妇均采集两份标本 , 一份 ( 阴道拭子 + 肛拭子 )用于实时荧光 PCR 检测 , 一份用于细菌培养。

　　1. 2. 3GBS 的分离培养及鉴定 标本尽快送至实验室 , 将拭子置于 3 mg/ml Todd-Hewrtt 肉汤 ( 含茶噬酸 15 Hg/ml+ 庆大霉素 8 Hg/ml), 在 35℃环境中增菌培养 18~24 h, 然后分别接种于小牛血清和羊血脂平板培养基 , 在 35℃ CO2浓度 5% 的环境中培养 24~36 h, 选择有 β 溶血环的菌落 , 通过革兰染色镜检查阳性 , 触酶试验阴性 , 将菌落接种于 rapidID32STAEP鉴定板条 , 在 37℃中培养 4 h, 读取结果 , 采用 VITEK-2 进行B 群链球菌细菌药敏 MIC 实验。

　　1. 2. 4定量 PCR 检测　提取阴道分泌物核酸 DNA, 将阴道拭子浸于 1mlTris-HCl 溶液中 ,加入溶菌酶至浓度至 100μg/ml,在37℃环境下震荡 3 min, 加入蛋白酶 K 至 200 μg/ml, 在 56℃条件下反应 3 h, 然后以 10000 r/min 离心 5 min, 取 200 μl 上清液提取 DNA, 具体步骤按照 DNA 提取试剂盒说明书操作。

　　GBS 的 PCR 检测按照 GBS 核酸检测试剂盒说明进行操作。

　　GBS 核酸荧光定量 PCR 检测按照 GBS 核酸荧光定量 PCR 试剂盒说明书进行操作。

　　1. 2. 5扩增测序　送上海生工生物工程股份有限公司测试分析。

　　1. 3观察指标　①实时 PCR 法与培养法检测 GBS 感染结果的对比 ；② GBS 药敏试验结果 ；③围生期孕妇 GBS 感染阳性者与阴性者的妊娠结局。

　　1. 4统计学方法　采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析。

　　计数资料以率 (%) 表示 , 采用χ2检验。

　　P<0.05 表示差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2. 1实时 PCR 法与培养法检测 GBS 感染结果的对比本组 410 例孕妇中 , 经培养法检测阳性者 23 例 , 阳性率为 5.5%(23/410), 实时 PCR 法检测阳性者 41 例 , 阳性率为10.0%(41/410), 两种检测方法的阳性检出率比较差异具有统计学意义 (χ2=5.491,P<0.05) ；以分离培养法为标准 , 实时荧光 PCR 法检测围产期孕妇 GBS 感染的敏感性为 100%(23/23),特异性为 95.6%。

　　2. 2培养法分离出 GBS 的耐药性检测结果　培养法共检出23 例 GBS 阳性者 , 对其进行进行药物敏感 MIC 实验 , 敏感度见表 1。

　　2. 3PCR 法检测 GBS 感染阳性者与阴性者妊娠结局的对比　GBS 阳性组与阴性组在早产发生率方面差异无统计学意义 (P>0.05), GBS 阳性组胎膜早破、宫内感染的发生率明显高于阴性组 , 差异有统计学意义 (P<0.05), 见表 2。【1】

　　
　　3 讨论

　　GBS 是一种常寄居阴道及胃肠道的兼性厌氧革兰阳性链球菌 , 多项研究表明［4, 5］, 围生期 GBS 感染会导致妊娠不良结局 , 据相关研究报道［6］, 我国妊娠妇女 GBS 带菌率为3.5%~32.4% , 研究 GBS 的检测方法、耐药性均对指导临床治疗具有重要意义。本组研究以 410 例产期孕妇作为研究对象 ,于孕 35~37 周时取孕妇阴道下 1/3 分泌物及肛周分泌物拭子 ,采用实时定量 PCR 和培养法法进行 GBS 检测 , 对培养分离出的 GBS 进行药敏试验 , 结果显示 , 实时 PCR 检测、培养法检测围产期 GBS 感染阳性率分别为 10.0% 和 5.5%, 均在上述研究报告的范围内 , 但二者差异显着 , 实时 PCR 检测的阳性率明显高于培养法。除此之外 , 培养法检测会受到标本采集、运送、培养条件等因素的影响 , 因而检出率会存在一定的变化 ；而实时 PCR 检测可有效规避上述因素 , 且检测时间仅为4 h, 本组研究中实时 PCR 检测的敏感性为 100%(23/23), 特异性为 95.6%。由此可见 , 其有望成为妊娠晚期检测 GBS 感染的首选方法。本组研究中对培养法共检出 23 例 GBS 阳性标本进行药物敏感 MIC 实验 , 结果显示 , GBS 对青霉素 、万古霉素、氨苄青霉素、头孢噻肟的敏感率均为 100.0%, 对左氧氟沙星的敏感率为 68.8%, 对克林霉素、阿奇霉素、红霉素的敏感率分别为 59.2%、45.2% 和 34.6%, 提示青霉素、氨苄青霉素为预防妊娠期 GBS 感染的理想抗生素 , 这与陈惠玲等［7］、Regan 等［8］研究结论具有一致性。本组 410 例孕妇中 , GBS 阳性组与阴性组在早产发生率方面无明显差异 ,GBS 阳性者组胎膜早破、宫内感染的发生率明显高于阴性者组 (P<0.05), 说明 GBS 感染会增加妊娠晚期孕妇宫内感染及胎膜早破的发生率 , 与李亚梅等［9］研究结论吻合 , 可进一步证实 , 围产期 GBS 感染会导致妊娠不良结局。

　　综上所述 , 实时 PCR 检测可作为孕晚期检测 GBS 感染的一种快速准确的方法 ；青霉素、氨苄青霉素为预防妊娠期GBS 感染的理想抗生素 ；GBS 感染会增加妊娠晚期孕妇宫内感染及胎膜早破的发生率。

　　参 考 文 献
　　
　　［1］ 孙丹华 , 王李利 , 张磊 , 等 . 妊娠 35~37 周孕妇Ｂ族链球菌带菌与妊娠结局 . 中国妇产科临床杂志 , 2013, 14(4):312-314.
　　［2］ 时春艳 , 曲首辉 , 杨磊 , 等 . 妊娠晚期孕妇 B 族链球菌带菌状况的检测及带菌对妊娠结局的影响 . 中华妇产科杂志 , 2010,45(1):12-16.
　　［3］ Verani JR, McGee L, Schrag SJ, et al. Prevention of perinatalgroup B streptococcal disease-revised guidelines from CDC 2010.Morbidity and Mortality Report, 2010, 59(RR-10):1-36.
　　［4］ Van Dyke MK, Phares CR, Lynfield R, et al. Evaluation f universalantenatal screening for group B streptococcus. N Engl J Med , 2009,360(25):2626-2636.
　　［5］ Gilbert GL.Vaccines for other neonatal infections.are group Bstreptococcal infections vaccine-preventable. Expert Rev Vaccines,2004, 3(4):371-374.
　　［6］ 马延敏 , 吴连方 , 黄醒华 , 等 . 孕妇Ｂ族溶血性链球菌带菌与母婴预后的关系 . 中华妇产科杂志 , 2000, 35(1):32-35.
　　［7］ 陈惠玲 , 邓家德 , 叶惠芬 , 等 . 围产期生殖道感染 B 族溶血性链球菌的耐药性及耐药基因检测 . 中华妇产科杂志 , 2010,45(9):71-73.