人生长激素的HPLC-IDMS联用高准确度绝对定量方法探析

　　1 引 言

　　人生长激素（ Human growth hormone,hGH） 是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的蛋白质，是一种肽类激素，是诊断巨人症、肢端肥大症、遗传性生长激素生成缺陷所致的生长激素缺乏症最常用的指标[1].

　　目前，临床检验中针对重组 hGH （ rhGH） 的检测方法有酶联免疫法[2,3]、时间分辨荧光免疫分析法[4]、LC-MS/MS 法[5,6]、毛细管电泳结合紫外和质谱技术[7]也为检测 rhGH 滥用后的浓度的差异提供了新途径。但这些方法都是相对测定法，耗时长、费用高、操作复杂。因此，亟需建立具有操作简单，高准确度和高精密度 hGH 的参考测量方法。

　　目前，纯蛋白的定量方法主要有氨基酸分析[8]、质量平衡[9]、定量核磁[10]、质谱法[11]以及同位素稀释质谱法[12,13].氨基酸分析法一般在氨基酸分析仪上通过紫外或荧光检测，因此易受干扰，操作比较复杂； 质量平衡法虽然具有高准确度，但其在标准物质定值方面具有一定的局限性； 定量核磁法具有无需待测物对照品、样品预处理步骤简单、测定快速准确、专属性强、不破坏样品等优点，但灵敏度较低； 同位素稀释质谱法具有操作简单，高准确度和高精密度的特点[13].

　　本研究采用快速蛋白液相色谱分离纯化 hGH,再采用 SDS-PAGE 和超高分辨能力 FTICR 对 hGH 进行纯度表征和分子量测定，为蛋白质结构的鉴定奠定基础。采用 KINETEX C18色谱柱在5 min 内快速分离 3 种氨基酸（ 脯氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸） .本方法具有操作简易、分析速度快、重现性较好、实用性强等特点，并且准确可靠。以此为基础建立了 hGH 的 HPLC-IDMS 联用高准确度绝对定量方法。

　　2 实验部分

　　2. 1 仪器、试剂与样品

　　Qtrap 5500（ 美国 AB 公司） ; Agilent 1200 （ 美国安捷伦公司） ; 垂直电泳槽（ 美国伯乐公司） ; AKTApurifier （ 美国 GE 公司） ; 12 T-FTICR 高分辨率质谱仪 （ 美国 Bruker 公司） ; ME235S 型天平 （ 感量0. 01 mg,德国 Satorius 公司） ; RC10-22T 型离心干燥机（ 美国 Thermo 公司） ; UFE500 烘箱（ 德国 Mem-mert 公司） ; 移液器（ 10 ”L,20 “L,100 ”L,200 “L,1000 ”L,法国 Gilson 公司） ; 美国 Milli-Q 超纯水系统。

　　标记氨基酸（13C5-脯氨酸、13C5-缬氨酸、13C9-苯丙氨酸，美国剑桥同位素实验室） ; 脯氨酸（ GBW（ E）100084,Pro） 、缬氨酸（ GBW（ E） 100055,Val） 、苯丙氨酸（ GBW（ E） 100061,Phe） 国家标准物质（ 中国计量科学研究院） ; hGH（ 安徽安科生物工程股份有限公司） ; 三氟乙酸（ TFA,中国 DikmaPure 公司） ; 乙腈（ 美国 J. T Baker 公司） ; 蛋白质预制胶（ 7 × 8 cm,胶厚 1. 0 mm,美国伯乐公司） ; 10 × SDS 缓冲溶液（ 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司） ; 彩虹预染宽分子量蛋白 Marker（ 10 ~260 kDa,中国中科瑞泰公司） ;其它试剂均为分析纯。实验用水为 Milli-Q 超纯水。

　　2. 2 hGH 纯化

　　将 1 mg hGH 溶于 1 mL 水中，经 0. 45 μm 滤膜过滤。将 1 mg/mL hGH 溶液，用 AKTA purifierHPLC 系统的 Jupiter C4色谱柱 （ 150 mm × 4. 6 mm,5 μm,Phenomenex,USA） 分离，柱温设为60℃； 流动相 A: H2O （ 含0. 1% TFA） 和流动相 B: CH3CN（ 含0. 1% TFA） ,流速为 1 mL / min,紫外检测器波长215 nm,分析时间 30 min,进行梯度洗脱，收集洗脱峰； 收集的洗脱峰浓缩干燥后用 0. 1% 甲酸复溶，进行蛋白质分子量及纯度的鉴定。

　　2. 3 hGH 基本性质表征

　　2. 3. 1 SDS-PAGE 纯度测定 冷冻干燥后，用洗脱峰收集液鉴定蛋白纯度。分析条件： 在垂直电泳槽内放入蛋白质预制胶，并加入 1 × 电泳缓冲液，使其被充分浸泡。在 1. 5 mL 离心管中以体积比 50∶ 20加入 hGH 样品和上样缓冲液，然后在 100℃水浴锅中煮沸 5 min,取出静置。从！20℃取出 Bio-Rad 双色蛋白 Marker,放至室温，离心待用。在蛋白预制胶的每个孔中上样 10 “L,电泳分析。电泳条件为电压100 V,分离时间为 90 min.分析结束后剥离凝胶用考马斯亮蓝染色 1 h,加脱色液（ 水-甲醇-冰醋酸，5∶ 4∶ 1,V / V / V） 过夜脱色。

　　2. 3. 2 FTICR-MS 分子量测定 FTICR-MS 配有 12. 0 T 超导磁体和电喷雾离子化源（ ESI+） ,检测范围 m/z 200 ~3000.冷冻干燥后的纯化蛋白用 0. 1%甲酸配制 0. 1 mg/mL hGH 溶液，取 500 ”L hGH 溶液，泵流速 10 “L/min,数据采集内存 2 M,256 次扫描，内标质量校正。分子量平行测定 6 次。

　　2. 4 HPLC-IDMS 法测定 hGH 蛋白质含量

　　2. 4. 1 标准溶液配制 准确称取 10 mg 脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸标准物质（ 准确至 0. 00001 g） ,分别溶于 10 mL 1% 甲酸中，配制成标准工作溶液，使用时用 1% 甲酸稀释 10 倍后使用。准确称取 10 mg 同位素标记脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸（ 准确至0. 00001 g） ,分别溶于 10 mL 1% 甲酸-水中，配制成标记标准储备液。同时配制脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸含量与样品中脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸含量接近（ 约 1∶ 1） 的标准溶液，经 0. 22 ”m 滤膜过滤后，用 HPLC-MS 分析。

　　2. 4. 2 hGH 样品的水解 称取 hGH 样品约 10 mg,溶于 10 mL 水中，配成 1 mg /mL hGH 溶液。分别取 200 “L hGH 溶液和标记氨基酸混合标准溶液，加到 2 mL 安瓿瓶中，真空离心干燥 30 min,取出后加入 500 ”L 6 mol/L HCl,通氮 2 min 除氧后密封，在 110℃的烘箱中进行水解，每隔 12 h 涡旋混匀 1 次。水解后用氮气吹干，用 500 “L 0. 1% HCl 复溶，经 0. 22 ”m 滤膜过滤后进行测定。

　　2. 4. 3 HPLC-IDMS 分析 采用 KINETEX C18色谱柱 （ 150 mm ×2 mm I. D. ,2. 6 “m; 美国 Phenome-nex 公司） .以 0. 1% TFA-乙腈 （ 90∶ 10,V / V） 等梯度洗脱 5 min,流速 200 ”L / min.质谱仪喷雾电压5. 0 kV; 壳气流速 2 MPa; 辅助气流速 0. 5 MPa; 干燥气温度 550℃ ; 碰撞能力 25.采用多反应检测模式（ MRM） ,分别监测如下离子反应对： 脯氨酸： 116->70（ Pro） ,121->74（ 标记 Pro） ; 缬氨酸： 118->72（ Val） ,123->76（ 标记 Val） ; 苯丙氨酸： 166->120（ Phe） ,175->128（ 标记 Phe） .