人生长激素的HPLC-IDMS联用高准确度绝对定量方法探析(2)

　　3 结果与讨论

　　3. 1 hGH 基本性质的表征

　　3. 1. 1 hGH 反相液相分离纯化结果 hGH 蛋白样品用 Jupiter C4 分析柱进行分离纯化的结果见图 1,SDS-PAGE 电泳纯度测定结果见图 2,发现 1 号峰和 2 号峰正是相对分子质量约为 21. 5 kDa 的蛋白。

　　3. 1. 2 FTICR-MS 分子量测定结果 傅里叶变换离子回旋共振质谱仪是一种具有超高分辨能力、高质量准确度、高扫描速度等性能的仪器[14].峰 2 的 FTICR-MS 谱图见图 3.图 3a 为电喷雾离子源正离子模式下获得的多离子峰，图 3b 为去卷积后所得到的蛋白质分子量，实测值22125. 38Da与hGH理论分子质量 22125. 07 Da 仅相差 0. 31 Da.峰 1 的 FTICR-MS 谱图见图 4.图 4a 为电喷雾离子源正离子模式下获得的多离子峰，图 4b 为去卷积后所得到的蛋白质分子量，实测值 22140. 62 Da 与 hGH 氧化的理论分子质量 22140. 05 Da 仅相差 0. 57 Da.说明 FTICR-MS 可以快速准确地获得蛋白质的分子质量信息。

　　3. 2 hGH 含量 HPLC-IDMS 测定结果

　　3. 2. 1 纯品 hGH 酸水解时间优化结果 为保证 hGH 能够定量的水解成氨基酸，需要优化水解时间，选取水解时间曲线的最高点或平台期作为最佳的水解时间。分别考察了水解时间为 12,24,48,72 和96 h,水解后的溶液中 Pro,Val 和 Phe 对标记的 Pro,Val 和 Phe 的相对比例，确定合适的水解时间。如图 5 所示，当水解时间为 48 h 时，3 种氨基酸的相对比例都达到了较稳定的平台期，因此选定 48 h 为hGH 的最佳水解时间。图 6 为 3 种氨基酸在 HPLC-MS / MS 的分离色谱图，5 min 内可快速分离 3 种氨基酸，Pro,Val 和 Phe 的保留时间分别为 1. 61,1. 93 和 4. 09 min.

　　3. 2. 2 HPLC-IDMS 绝对定量 hGH 目前，对蛋白质的绝对定量研究主要集中在同位素稀释质谱法（ IDMS） ,IDMS 法具有操作简单，准确度和精密度高的特点。本方法通过测氨基酸来定量分析蛋白质的含量。HPLC-IDMS 法绝对定量 hGH 蛋白质浓度结果见表 1.从表 1 可见，HPLC-IDMS 法的重复性好，hGH 蛋白质浓度的 RSD 为 0. 5%（ n =3） ,因此本方法可通过测定高丰度、高稳定性的氨基酸定量分析蛋白质含量，精密度与再现性较好。利用本方法参加国际比对，本实验室的数据与日本计量院韩国标准科学研究院 KRISS 的数据都比较接近，验证了所建方法的可行性，为血清中蛋白及其它基体样品中蛋白的定量分析提供了新的思路和手段。