肾上腺色腙使用石墨烯量子点荧光探针的测定(2)

　　3. 2. 2 缓冲溶液 pH、种类及用量的选择。

　　不同 pH 对体系 ΔF 值的影响不同。实验考察了不同 pH 对体系荧光强度的影响，结果表明，pH = 7. 40 时，体系的 ΔF 值最大。同时考察了同一 pH 值下 Na2HPO4-NaH2PO4、Tris-HCl、B-R、柠檬酸-Na2HPO4和 NaOH-KH2PO4等缓冲溶液对体系荧光强度的影响。当缓冲溶液为 Tris-HCl 时，肾上腺色腙对 GQDs 体系的猝灭作用最强，其适宜用量为 3. 00 mL.所以本实验选择 3. 00 mL 的Tris-HCl 缓冲溶液来调节体系酸度。

　　3. 2. 3 GQDs 浓度的选择。

　　量子点的浓度直接影响着体系的灵敏度和线性范围。我们试验了不同用量的量子点对体系荧光强度的影响。结果表明，当量子点用量为 3. 00mL 时，体系的猝灭程度最大。实验选择加入3. 00 mL的量子点，其浓度为 2. 3 × 10- 3mol / L.

　　3. 2. 4 增敏剂对体系的影响。

　　试验了一系列的金属离子和纳米粒子对肾上腺色腙猝灭量子点的荧光强度的协同作用。如Cu2 +、Ba2 +、Ca2 +、Mg2 +、Mn2 +、Zn2 +、AgNP 和AuNP,结果均无明显影响。表面活性剂对体系有强的增敏、增溶、增稳作用，因此实验研究了十二烷基苯磺酸钠（ SDBS） 、十二烷基三甲基溴化铵（ DTAB） 、吐温 80（ Tween-80） 、溴化十六烷基三甲基铵（ CTMAB） 、β-环糊精（ β-CD） 等对体系猝灭程度的影响。结果表明，上述几种表面活性剂和β-环糊精对体系 ΔF 值均无增敏作用。所以，本实验选择不加入任何增敏剂。

　　3. 2. 5 反应时间及试剂加入顺序的影响。

　　配制好溶液，每隔 10 min 测定一次荧光强度。结果表明，肾上腺色腙对 GQDs 的猝灭程度在反应 20 min 后最大，且荧光强度在 4 h 内基本稳定。试剂加入顺序对体系荧光强度几乎没有影响。

　　3. 2. 6 共存物质干扰。

　　在选定的实验条件下，当肾上腺色腙浓度为4. 0 × 10- 6mol / L 时，以相对误差不超过 ± 5% 为限，1 000 倍的葡萄糖、果糖、蔗糖，500 倍的 Ca2 +、K+、Sr2 +、Ba2 +,100 倍的 Cu2 +、Al3 +、Zn2 +,5 倍的Fe3 +不干扰测定。

　　3. 2. 7 检出限和线性范围。

　　在优化的实验条件下，肾上腺色腙溶液在4. 0 × 10- 7~ 1. 2 × 10- 5mol / L 浓度范围内与 ΔF呈良好的线性关系，线性回归方程为 ΔF = 2. 5 ×107c（ mol / L） + 10. 3,相关系数为 0. 995 6.对浓度为 4. 0 ×10- 6mol / L 的肾上腺色腙溶液平行测定 5 次，其相对标准偏差为 0. 15%.根据 IUPAC建议计算，方法检出限为 1. 5 ×10- 7mol / L.

　　3. 2. 8 样品分析。

　　随机抽取同一批号的肾上腺色腙片剂 20 片，准确称取其质量，研磨，称取适量粉末（ 相当于0. 023 6 g肾上腺色腙） ,用蒸馏水溶解并超声 5min 后定容于 100 mL 容量瓶中，摇匀，静置 10min,干过滤，弃去初滤液，移取一定量后续过滤溶液，按照实验方法测定，同时进行加标回收实验，结果见表 1.

　　3. 3 机理讨论。

　　在荧光发射过程中，荧光试剂在不同的溶剂中通过和其他物质的分子、离子碰撞导致荧光强度会迅速减弱以致完全失去荧光，称为荧光猝灭。

　　导致荧光猝灭的因素很多，主要包括激发态反应、能量转移、生成配合物和碰撞猝灭等[17].碰撞猝灭又称为动态猝灭。静态猝灭是由于生成配合物而引起的荧光猝灭。本实验通过温度对猝灭常数的影响和紫外-可见吸收光谱的变化来探讨肾上腺色腙和量子点之间的作用机理。

　　3. 3. 1 紫外-可见吸收光谱。

　　静态猝灭是猝灭剂与基态荧光分子形成无荧光或弱荧光的配合物，从而改变荧光物质的吸收光谱。固定量子点和肾上腺色腙溶液的浓度，以缓冲溶液为参比，分别做 GQDs、CBZC、GQDs +CBZC 的紫外-可见吸收光谱，如图 6 所示。从图中得知，肾上腺色腙在 353 nm 处有最大吸收，GQDs 加入后，最大吸收波长未发生变化，吸光度明显增大。但通过比较发现，GQDs + CBZC 体系的吸光度是 GQDs 和 CBZC 二者的吸光强度之和，说明肾上腺色腙和量子点没有生成配合物，由此证明肾上腺色腙对量子点的荧光猝灭机理可能为动态猝灭。

　　3. 3. 2 温度对猝灭常数的影响。

　　动态猝灭是猝灭剂与荧光试剂的激发态分子之间发生相互作用的过程。随着温度的升高，分子之间的有效碰撞增加，电子转移过程加剧，这种变化遵守 Stern-Volmer 方程[18]:

　　1 + KSV[Q].其中，F0和 F 分别为无猝灭剂和有猝灭剂时的荧光强度，τ0是不存在猝灭剂时的荧光分子的平均荧光寿命，KSV为 Stern-Volmer 猝灭常数，[Q]为猝灭剂的浓度，Kq为双分子猝灭过程速率常数。

　　依据 Stern-Volmer 方程，对 F0/ F 和[Q]进行线性回归，所得直线的斜率为 KSV.如图 7 所示，在 293 K 和 313 K 条件下，肾上腺色腙的[Q]和F0/ F 线性关系良好，说明只存在一种猝灭方式，静态猝灭或动态猝灭。通过比较，随着温度的升高 KSV逐渐增大，说明肾上腺色腙与 GQDs 是以动态猝灭的方式发生相互作用的。

　　3. 3. 3 结合常数、结合位点数、热力学参数及作用力类型

    以 lg[（ F0- F） / F]对 lg[Q]作图，直线的斜率为结合位点数 n,截距为 lgKA.由表 2 数据可知，量子点和肾上腺色腙的结合位点数 n≈1,结合常数 KA均比较大，说明二者具有较强的结合作用。KA也随着温度的升高而增大，表明肾上腺色腙对量子点的猝灭为动态猝灭。

　　利用 Vant'Hoff 方程可以计算出热力学参数焓变 ΔH、熵变 ΔS、吉布斯自由能 ΔG:

　　根据公式计算得出各热力学参数，如表 2 所示。

　　ΔG < 0,表明该反应可自发进行； 而在肾上腺色腙和量子点结合的过程中，ΔH > 0,ΔS > 0,表明肾上腺色腙和量子点之间的作用力为疏水作用力，原因可能为肾上腺色腙表面的羟基和量子点表面的羧基发生脱水而产生的疏水作用力。

　　4 结 论。

　　通过高温裂解柠檬酸的方法并经过 PEG2000修饰钝化合成了石墨烯量子点。通过红外光谱、荧光寿命和紫外-可见吸收光谱等方法对其进行了表征。在 pH = 7. 40 的 Tris-HCl 缓冲液介质中，肾上腺色腙对量子点荧光有很强的猝灭作用，据此建立了以石墨烯量子点为荧光探针定量测定肾上腺色腙的新方法。该方法快速、简单，可用于样品中肾上腺色腙的含量测定。通过测定温度对猝灭常数的影响和吸收光谱的变化探讨了二者的猝灭机理。结果表明： 肾上腺色腙与石墨烯量子点之间是以动态猝灭的方式发生相互作用，二者之间为疏水作用力。该方法为研究量子点和药物间的相互作用提供了一定的实验依据，同时为测定肾上腺色腙提供了新方法。

　　参 考 文 献：

　　[1]DONG Y Q,SHAO J W,CHEN C Q,et al. . Blue luminescent graphene quantum dots and graphene oxide prepared bytuning the carbonization degree of citric acid [J]. Carbon,2012,50（ 12） : 4738-4743.

　　[2]WU Z Z,LI W Y,CHEN J,et al. . A graphene quantum dot-based method for the highly sensitive and selective fluores-cence turn on detection of biothiols [J]. Talanta,2014,119: 538-543.

　　[3]王娇娇，冯苗，詹红兵。 石墨烯量子点的制备 [J]. 化学进展，2013,25（ 1） : 86-94.

　　WANG J J,FENG M,ZHAN H B. Advances in preparation of graphene quantum dots [J]. Prog. Chem. ,2013,25（ 1） : 86-94. （ in Chinese）[4]AMJADI M,MANZOORI J L,HALLAJ T. Chemiluminescence of graphene quantum dots and its application to the deter-mination of uric acid [J]. J. Lumin. ,2014,153: 73-78.