动物模型及细胞研究中CRISPR/Cas9基因编辑技术的运用

　　摘    要：　CRISPR/Cas9是从细菌中发现的一种用Cas9核酸酶对外源DNA进行切割从而保护自身基因完整性的防御机制。通过对其结构中指导性RNA的改变即可便捷地对其识别位点进行改变，在基因编辑的应用方面具有很大潜力。论文主要概述CRISPR/Cas9系统的组成、机制以及优缺点，同时介绍CRISPR/Cas9系统在科学研究、动物疾病治疗以及一些由基因改变导致的疾病模型方面的应用，对CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展进行预测。

　　关键词：　CRISPR/Cas9; 基因编辑; 疾病模型; 基因治疗;

　　Abstract：　CRISPR/Cas9 is a defense mechanism found in bacteria that use CRISPR-associated protein 9(Cas9) nuclease to cut foreign DNA to protect the integrity of their own genes.It is found that by changing the guiding RNA in its structure, its recognition sites can be easily changed, which has enormous potential in the application of gene editing.This paper mainly summarized the composition, mechanism, advantages and disadvantages of CRISPR/Cas9 system, and introduce the application of CRISPR/Cas9 system in scientific research, animal disease treatment and some disease models caused by gene change.Finally, development of CRISPR/Cas9 gene editing technology is predicted.

　　Keyword：　CRISPR/Cas9; gene editing technology; disease model; gene therapy;

　　基因编辑技术是分子生物学研究中的重要手段，通过对目的片段序列的改变，从而影响基因的功能。它的出现推进分子生物学的进程，提高了对于基因结构功能的研究效率。目前基因编辑的主要手段有3种，包括锌指核酸酶 (zinc finger endonuclease, ZFN)技术、转录激活因子样效应物核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技术和CRISPR/Cas9技术[1]。其中ZFN由于构建繁琐，逐渐被TALEN和CRISPR/Cas9所取代。CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌中对于外源DNA的一种防御机制，主要功能是对外源侵入的噬菌体以及外源质粒进行切割，破坏DNA结构，使其失去活性，无法转录以及翻译蛋白对自身产生影响。CRISPR/Cas系统最早于1987年被发现有规律的重复序列，这些重复序列与噬菌体内序列高度同源。Ⅱ型Cas9有核酸内切酶活性[2]。在小鼠上实现基因编辑操作，将CRISPR/Cas9应用于实际操作[3]。与TALEN相比，CRISPR/Cas9具有更加简单的构建过程和高效的剪切效率，但脱靶效应也是限制其发展的核心问题之一。近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术广泛用于构建动物模型以及细胞层面的研究。
 

　　1、 CRISPR/Cas系统组成

　　1.1、 CRISPR/Cas结构与分类

　　CRISPR/Cas系统依Cas蛋白的不同可分为2个大类，5个亚型[4]。其中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ为第1类，Ⅱ、Ⅴ为第2类[10]。CRISPR/Cas系统分为CRISPR序列和Cas蛋白，CRISPR序列是一段DNA序列，由多个重复的单元构成，每个单元由一段长度为24 bp～48 bp的高度保守的重复序列和26 bp～72 bp的间隔序列组成，称为簇状短回文间隔重复序列[5]。间隔序列是与外源DNA同源的序列，通过转录CRISPR-derived RNA(crRNA)指导Cas蛋白对目的序列的匹配。另一个部分是Cas蛋白家族和crRNA与Trans-activting crRNA(trRNA)形成的复合体，Cas蛋白家族的基因序列位于CRISPR序列上游与之相邻，每一个类型的CRISPR/Cas系统所含的蛋白不同，功能亦不同。

　　1.2、 CRISPR/Cas功能

　　CRISPR/Cas系统中CRISPR序列的功能是整合与指导作用，通过转录出crRNA指导Cas蛋白对目的序列进行精准切割。是一段与外源DNA同源的DNA序列，由Cas1、Cas2和Cas4将外源序列剪切后添加到CRISPR序列中。Cas蛋白是CRISPR/Cas系统中的功能运行单位，不同Cas蛋白配合将外源DNA序列进行处理，整合获取外源序列信息，之后由具有DNA内切酶活性的Cas蛋白对目的序列进行切割，破坏外源DNA结构达到防御目的，这一过程中需要CRISPR序列转录的crRNA指导及trRNA的激活，形成有活性RNA-Cas蛋白复合体。

　　2、 CRISPR/Cas系统运行机制

　　CRISPR/Cas系统由于组成不同可分为外源DNA侵入与处理、前体crRNA转录加工和Cas蛋白识别切割三个阶段。以Ⅱ型CRISPR/Cas系统为例。首先是外源DNA侵入到细胞内部并在细胞内部展开，暴露出其DNA序列，之后4个Cas1与2个Cas2蛋白形成一个复合体，根据外源DNA的形状不同附着其上进行切割[6]。位置位于重复序列的5′端称为原间隔序列的部位，形成一段短的DNA片段，此DNA片段会被插入到CRISPR序列的前端位于前导序列后的第1个重复序列上。第二步是CRISPR序列由RNA聚合酶进行转录，CRISPR序列转录出前体crRNA[3]。此crRNA无活性，包含CRISPR序列启动子后所有的重复序列与间隔序列单元。CRISPR序列中的重复序列会转录出于前体crRNA序列中互补的trRNA[7,8]。当前体crRNA中的一个crRNA单元与互补的trRNA配对后同时与Cas9蛋白结合时由RNase Ⅲ对前体crRNA进行切割形成具有活性的crRNA,一个完整的具有切割外源DNA活性crRNA-trRNA-Cas9复合体形成。第3步是Cas9蛋白复合体对外源DNA进行切割，降解外源DNA,此过程是Cas9蛋白复合体对目的序列的识别。是由Cas9蛋白先对目标DNA上的PAM序列进行识别出匹配的protospacer adjacent motif(PAM)序列后由Cas9蛋白复合体内的crRNA序列与PAM序列后长度约为23 bp的DNA序列的互补链进行匹配。成功后Cas9蛋白的酶切活性区域在PAM序列的5′ 端进行切割，形成DNA双链断裂破坏DNA结构完整性使外源DNA失活，完成一个完整的防御外源DNA过程。

　　3、 CRISPR/Cas9缺陷及优化

　　天然的CRISPR/Cas系统十分复杂且过于庞大，第1类中的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型CRISPR/Cas系统由于其中的Cas蛋白种类多，且识别与切割目的序列的部位于同一个Cas蛋白上，在应用中不易操作，所以不常用于基因编辑处理，第2类中的Ⅱ、Ⅴ型CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白种类少，且识别与切割目的DNA序列的结构都位于同一个Cas蛋白上，是实际应用中的理想材料。

　　在基因编辑操作中只需要CRISPR/Cas系统中对于目的序列的识别与切割的能力，因此CRISPR序列就成为可去除的非必要部分，只保留能够正常转录翻译Cas9蛋白的DNA序列。在基因编辑操作中通常只有1到2个目标位点，不需要CRISPR序列中完整庞大的多余序列，所以CRISPR序列可被人为转录的crRNA所代替，省略前体crRNA的处理步骤。此外，同过将trRNA与crRNA连接在同一条RNA链上形成单一的引导RNA (gRNA) 可进一步简化Cas9在实际应用上的操作。常用的Cas9主要有从链脓杆菌 (Streptococcus pyogenes,spCas9)中获得的spCas9和从金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus,saCas9) 中获得的saCas9[8,9]。spCas9被广泛应用于动物的基因编辑操作，而saCas9因其序列较短更加适合由噬菌体携带，因此更适用于基因治疗的研究。不同Cas9蛋白识别的PAM序列不同，根据使用要求，采用噬菌体共进化的方法，产生多种spCas9的亚种可识别多种长度，序列不同的PAM序列[10]。进一步扩大Cas9可识别的DNA序列范围，达到更加灵活的应用。

　　dCas9是一种没有DNA内切酶活性的Cas9蛋白变体。其可以同gRNA与DNA的匹配结合到目的序列上，但不能够对DNA双链进行切割，形成DNA双链断裂，可以额外连接上切割DNA双链中一条链的酶，设计两个切割位点，从而提高编辑精确程度。在动物试验中，为了获得正确的试验体，对于切割靶点的选择以及gRNA序列的设计，选择合适的靶点以及gRNA设计是对于降低脱靶效率的关键步骤。对Cas9蛋白的不断突变产生多种识别不同PAM序列的变体，一方面扩展Cas9可识别的序列种类，也降低脱靶的可能性[11]。从Cas9蛋白入手将限制性内切酶的Fok I区连接到无催化活性的Cas9 (dead Cas9,dCas9) 上，当两个dCas9形成二聚体才能切割形成DSBs, 设计两个gRNA靶点来切割一个位点，来降低脱靶效率[12]。用GAL4/UAS二元系统对CRISPR/Cas9进行改造，使其可以在果蝇中组织特异性表达，增加CRISPR/Cas9的精准性，降低脱靶可能带来的危害。对于实验体的脱靶检测也是于设计相对应的步骤，选择合适的检测手段，降低假阳性与假阴性的出现，提高检测精准度[13]。

　　4、 CRISPR/Cas9应用

　　4.1、 研究领域应用

　　4.1.1 、基因敲入与敲除

　　CRISPR/Cas9系统最常用于基因敲除与敲入，对于某些基因位点的敲除效率能达到95%以上[14]。用Cas9蛋白作为DNA内切酶靶向切割DNA序列，产生DNA双链断裂，经由细胞内的同源重组(HDR)或非同源末端重组(NHEJ)将DSBs修复。HDR修复常用于Cas9基因编辑操作，可以根据人为提供的具有同源臂的模板进行DBSs的修复，达到基因敲入的操作。设计两条gRNA对目的序列上、下游进行匹配达到基因定点敲除的操作。将Cas9基因连接上具有组织特异性表达的启动子并整合到基因组中，可实现Cas9组织特异性的表达，达到具有组织特异性的切除目的DNA的能力[13]。对于某些致死基因的敲除可使用cre-LoxP系统制备条件性敲除的动物模型使目的基因在动物体内有条件性地敲除保证个体存活[14,15]。条件性敲除需要的制备两个LoxP插入位点的donor, 在小鼠试验中发现双donor效率要低于整合的单donor效率[16]。在基因序列中插入LoxP序列难度较大需要多次断裂重组，在斑马鱼中实现了不需要HR的一步插入LoxP序列的方式。在敲入操作中同样由于会有目的基因序列的插入需要制备donor, 因此对于细胞的修复方式就更倾向于准确性更高的HR修复[17]。在兔模型中敲入操作中HR修复促进剂RS-1对提高插入成功率有显着效果，而NHEJ抑制剂SCRP-7对于敲入成功率无显着影响[18]。随着更多的Cas蛋白的开发，CRISPR/Cas9系统有了更多的功能，最常用的仍是其基本的敲入与敲除功能。

　　4.1.2 、DNA单碱基突变

　　大多数基因编辑操作都是基于对DNA双链切割形成DSBs后通过细胞内修复方式进行，这种方法可插入或去除较长的基因序列，对于单个核苷酸的突变需求操作过于繁琐。Cas9的突变体dCas9由于人为突变失去了对DNA双链切割形成DSBs的酶活性，将dCas9与胞苷脱氨酶混合后可将胞嘧啶变为尿嘧啶从而形成C-T,G-A的突变达到点突变的效果，此方法不需要形成DNA双链断裂，降低错配可能性，提高编辑效率。此外dCas13可对RNA进行点突变，在不改变DNA序列的情况下对转录后修饰有很大的应用空间。

　　4.1.3、 表观遗传调控

　　表观遗传调控是不改变DNA序列而对性状进行调控，用dCas9突变失去切割DNA双链的能力，保留对于目标序列的识别能力，设计一段与转录启动子等相关原件匹配的gRNA序列使dCas9能够识别并结合在目标位点上，同时可在dCas9上连接相应的激活或抑制蛋白，达到激活或抑制目标DNA的转录，以此来调控生物个体的性状。

　　4.2 、动物医学领域应用

　　4.2.1、 疾病模型构建

　　用CRISPR/Cas9进行动物疾病模型的构建是基于其对基因的插入以及缺失的功能，构建各种基因缺陷型的疾病模型来模拟各种情况。心脑血管疾病、糖尿病、肥胖等都可以用CRISPR/Cas9 进行模型的构建。CRISPR/Cas9能够构建的动物疾病模型类型多范围广，不论是小动物模型诸如小鼠、大鼠、斑马鱼等或是大动物模型如兔、猪等都可使用。从2013年成功用CRISPR/Cas9系统对小鼠受精卵进行编辑后，许多不同疾病模型相继构建成功[19,20,21,22]。近年来用CRISPR/Cas9 进行模型构建的技术趋于成熟，对疾病的发病机制有很大帮助。有研究成功构建出肺鳞状细胞癌的小鼠模型，并在此基础上进行了免疫疗法的试验[23]。通过CRISPR/Cas9 在Notch3的第33个外显子上插入了终止序列阻止其完整翻译蛋白，致小鼠表现出脑膜侧综合症的症状，并在大动物模型构建方面成功构建出猪的亨廷顿氏舞蹈症模型，阐述了亨廷顿氏舞蹈症模型中的神经退行性变化[24]。

　　4.2.2、 基因治疗

　　基因治疗的一个策略是使用腺病毒作为载体搭载Cas9系统的DNA,较为合适的是SaCas9蛋白。SaCas9蛋白的基因组序列很短约为3 300 bp, 适合由经过改造的腺病毒携带，注入到细胞内部[25]。研究表明，用腺病毒携带saCas9蛋白基因，将其运送到被人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的T细胞内，对新产生的HIV进行切割，阻止其继续扩散至其他细胞，有效降低HIV的扩散，达到对HIV的抑制[26]。在人类胚胎中用CRISPR/Cas9修正了MYCBPC3基因的致病性突变解决了胚胎的遗传性肥厚型心肌病[27]。通过对遗传性酪氨酸血症小鼠用注射的方式成功使小鼠的部分肝细胞表达Fah蛋白缓解了体重降低的现象[28]。CRISPR/Cas9系统在肿瘤的免疫疗法中的可行性已得到初步验证，在非小细胞肺癌的免疫治疗中，将患者自身的T细胞取出并用CRISPR/Cas9系统敲除PD-1基因后进行扩增，再注入患者体内以达到抗肿瘤的目的[29]。

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