CRISPR/Cas系统介导的基因编辑技术

　　近年来随着人类基因组测序的完成和全基因组测序技术的不断发展，复杂基因组中未知基因功能的探索对生物学的定点研究、临床医学及基因治疗都有着不可替代的作用。长期以来，基于同源重组机制的基因敲除技术已在基因功能研究中被广泛采用，但是该技术在实际工作中存在着效率太低、费时费力，而且有可能导致基因突变等问题，使基因功能的研究变得困难。随着生物技术的发展，基因组编辑技术经历了三代技术的发展，即锌指核酸酶（zinc finger nucleases,ZFNs）、转录激活子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nu-cleases,TALENs）和规律性重复短回文序列簇与Cas9蛋 白 （clustered regularly interspaced shortpalindromicrepeats,CRISPR/Cas9）。这三种技术都能够根据人工设计在基因组的特定位置造成DNA双键断裂。细胞会通过DNA同源重组或者非同源末端连接机制修复双链断裂。在同源序列（外源引入或同源染色体存在的情况下，同源重组修复（homologous recombination repair,HDR）可实现外源基因的插入或基因的靶向修复；在没有同源序列的情况下，细胞趋向于利用非同源的末端连接（nonhomologous end joining,NHEJ）进行DNA的修复，它可能引入或删除一个或多个碱基从而造成基因移码突变，使相关基因被敲除。

　　1锌指核酸酶基因编辑技术
　　
　　1.1锌指核酸酶的结构及作用原理

　　锌指核酸酶（zinc finger nucleases,ZFNs）由锌指蛋白结构域和能识别特异性DNA链的切割结构域连接形成并发挥切割DNA的作用。ZFN由3~4锌指蛋白组成，可以结合9个~12个核苷酸，每个锌指蛋白可以识别3bp DNA,当两个锌指蛋白模块结合时可以最有效的结合特异性位点，且每个锌指模块 可 以 识 别6bp DNA.Ⅱ型限制性内切酶FokⅠ催化DNA双链断裂，当切割结构域发生二聚化体时才会断裂DNA.所以两个相邻的ZFN对必须保持合适的距离，才能发生二聚体化。

　　ZFN可以结合并切割一段DNA序列，并产生DNA双链断裂。

　　ZFN诱导的双链断裂可以通过NHEJ和HDR两种修复方式，NHEJ会在靶位点随机的引入基因或删除基因，HDR通过外源性模板在靶位点进行修复[1].此外，FokⅠ突变体需要异源二聚化得到发展，这可以极大提高对特异性序列的识别并减少对靶点外的位点的切割。

　　DNA分子可以和锌指蛋白结合，产生邻近序列效应并与相邻的结构域相互作用，这既增加了结合物的特异性，也为结合物的设计带来了挑战。

　　1.2 ZFN的构建
　　
　　当前存在3种不同ZFNs构建方法，即模块组装法（modular assembly），寡池工程法（oligomerizedpool engineering,OPEN）和由Sangamo Biosciences公司开发的方法。模块组装法通过标准的DNA重组技术将预选的ZF组装成多锌指的ZF组合模块。

　　OPEN法是通过ZF库获得识别3bp DNA位点的ZF池。Sangamo Biosciences公司开创的方法则可将锌指结构组装成更长的ZF组合模块。

　　1.3 ZFN技术的应用

　　基因编码的ZFN的表达与对内源性基因位点的断裂得到广泛的应用。包括人、斑马鱼、仓鼠、小鼠、猪、青蛙、昆虫、蛔虫和疟原虫。

　　2010年OsakabeK等[2]将带有热休克蛋白启动子的ZFN基因，稳定导入拟南芥中，并成功敲除AB14基因。2011年LiH等[3]利用ZFN结合未突变的功能基因共转染，治愈血友病B型家鼠，试验充分展现了ZFN的巨大潜力。更为重要的是他们将治疗引入体内，为基因疾病的治疗提供了一个可行的方案。近几年，ZFN技术在农业中得到广泛应用，通过ZFN进行突变育种可以改变植物构造、花期和成熟期，并获得了3 000多种新型品种[4].ZFN可用于内源性基因的改变，2014年Chen L等[5]

　　证明通过特定基因中序列突变实现的反向遗传法可用于高通量基因组分析。

　　2 TALEN技术

　　2.1 TALEN的结构及作用原理

　　转录激活子样效应因子核酸酶（transcriptionactivator-like effector nuclease,TALEN）系统的发现来自于对黄杆菌属的研究，黄杆菌属分泌的效应蛋白（TALE）可以效仿真核转录因子与DNA结合并催化靶向DNA表达。TALE蛋白由DNA结合结构域，核定位信号和靶基因转录催化结构域组成。

　　DNA结合结构域由多个单体组成，每个单体可以与一个靶位点的核苷酸结合。每个单体是34个氨基酸残基串联重复组成，第12和13位氨基酸高度特异（RVD），决定了对特异性核苷酸的识别，如Asn和Ile（NI）识别A,Asn和Gly（NG）识别T,2个Asn（NN）识别G,His和Asp（HD）识别C,第1个氨基酸残基用于稳定空间构象，第2位氨基酸识别核苷酸，通过NH或NK识别G可以减少脱靶效率。不同的RVD结合DNA的效率不同。人工构建的TALEN系统由核定位信号，TALE蛋白，半重复片段，N-末端结构域和Fok Ⅰ催化结构域组成。

　　TALENs系统识别两条反向的DNA位点，两位点由12bp~25bp DNA片段隔开，并在双氨基酸残基（NN、HD、NI、NG）的识别作用下与靶序列结合，Fok Ⅰ配 对 二 聚 体 化，使DNA双 链 断 裂[6].

　　DNA结合结构域不能与所有识别的位点结合，只有在打靶序列5′端存在T碱基才会结合。双链断裂（double-strand breaks,DSB）诱发DNA损伤修复机制，细胞要通过两种途径来修复，即NHEJ和HDR.当没有外源的同源序列加入时，细胞就会启动NHEJ修复机制，将断开的DNA末端重新结合在一起，但是这种修复机制是一种存在缺陷的修复过程，往往会引入新的突变，因此也就达到了进行基因敲除的目的。如果此时加入外源的同源碱基序列就可以启动第二种修复机制HDR,利用同源修复机制，可以帮助我们实现基因敲进和基因修复。即使外源的同源序列存在缺陷，同样可以达到基因敲除的效果。

　　2.2 TALEN表达载体的构建

　　TALEN表达载体的构建技术为全序列人工合成法，包括Golden Gate法，REAL法，单元组装法。Golden Gate法是通过IIS型限制性核酸内切酶介导的克隆方法，该方法是目前在TALEN载体构建中应用最广泛的方式之一。REAL（restriction en-zyme and ligation）法是一种基于反复酶切-连接-转化-筛选的组装法，由Sander等[7]的实验室发明。

　　单元组装法是Huang P等[8]发明的另一种基于酶切-连接的TALE结构域组装法。

　　2.3 TALEN技术的应用自2014年以来，TALEN已成功地在犬、小鼠、海鞘、人和大麦生物中进行了基因组定点编辑。

　　To-kuda S等[9]利用TALEN技术成功敲除犬肾细胞中的ZO-1基因，并证明了该基因的敲除使细胞接触之间的肌球蛋白组织发生改变，而且紧密连接蛋白的位点遭到破坏，从而揭示了ZO-1基因在犬肾细胞之间的连接所担任的角色。Chen K等[10]通 过TALEN技术成功敲除了大麦中的grf基因，达到了很高的效率，而且该敲除基因可以稳定地遗传给后代。以此证明了TALEN可用于检测基因功能，改变大麦表型并可用于其他作物物种。

　　Liu Y等[11]开发了一种新的策略，通过被双荧光标记TALEN敲除了纯合子小鼠中的Ttc36基因，并且用单侧肾切技术检验表型，最后证明了新开发的TALEN策略与单侧肾切技术结合可以更好地用于肾脏发育和肾脏疾病方面的研究。

　　Park C Y等[12]用TALEN技术使人类多能干细胞中F8基因颠倒，用来构建血友病细胞系模型，表明只有正常连接的F8基因才能正常转录mRNA,证明了TALEN可用来建立与染色体重排有关的疾病细胞模型，也可以用于改变染色体颠倒带来的缺陷，为血友病的治疗和其他基因疾病的治疗提供了理论依据。

　　Liu J等[13]通过优化TALEN的复合结构，极大地提高了转染效率，并成功敲除了女性干细胞中HPRT1基因，使敲除效率达到了15%.

　　Treen N等[14]通过电转染将TALEN载体转入海鞘特异性组织中并达到了很高的转染效率，并成功敲除了Hox12和Fgf3基因，并通过此方法揭示了海鞘中Fgf3基因功能。

　　3 CRISPR/Cas系统介导的基因编辑技术

　　3.1 CRISPR/Cas系统的结构及作用原理

　　规律性重复短回文序列簇（clustered regularly-interspaced short palindromic repeats,CRISPR/Cas）系统是细菌和古生菌中以RNA为基础的免疫系统[15],CRISPPR/Cas系统中含有一个编码Cas9核酸酶基因和两个编码导向RNA的基因，即反式激 活crRNA（tracrRNA）和 前 导crRNA（pre-crRNA）.

　　precr RNA位点包括一系列的重复序列（30bp~40bp）和间隔序列。

　　crRNA和tracrRNA（trans-activating crRNA）配对与Cas9蛋白形成核酸复合物（RNP），并识别携带PAM标记的DNA序列，通过Cas9蛋白中的RuvC和HNH切割结构域发挥打靶作用。以化脓链球菌中Ⅱ型CRISPR系统应用最为广泛，Cas9蛋白作为该系统的主要特征，它参与Pre-RNA加工为成熟的crRNA,以及对外源DNA的靶向切割[16].Cas9蛋白包含N端RuvC和中间的HNH两个活性位点。Pre-RNA作为导向序列被直接重复序列隔开，经过加工成熟与tracrRNA结合，也可以被一个导向RNA（gRNA）替换。

　　Cas9蛋白结合靶向DNA的特异性由gRNA-DNA对和PAM决定，PAM作为靶序列上核苷酸标志，不同的CRISPR/Cas系统识别的PAM的不同。

　　对 于CRISPR/Cas的作用机理以Ⅱ型CRISPR/Cas系统为例，可以分为三个阶段。第一阶段，当外源DNA入侵时，核酸中的一小段DNA序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRISPR的5′端的两个重复序列之间（repeats），从而在5′端的富含AT的重复序列之间形成间隔序列。第二阶段，CRISPR基因座转录成Pre-crRNA,Pre-crRNA在Cas9蛋白作用下加工成熟为crRNA,由一个间隔序列和部分重复序列组成。第三阶段，外源DNA入侵时CRISPR的表达很快被诱导 上 调，发挥定点编辑作用，即crRNA与tracrRNA形成导向的双链RNA（sgRNA），对入侵的外源核酸进行靶向的定位并介导Cas9核酸酶对外源核酸进行切割降解。

　　3.2 CRISPRs系统的构建CRISPR系统体外构建的一般步骤：

　　①定向双链RNA（guide RNA,sgRNA）的设计。crRNA与tracrRNA形成的双链RNA（guide RNA,sgRNA）介导双链DNA剪切，sgRNA中导向序列决定了Cas9核酸酶的特异性。CRISPRs系统中，靶序列必须在5′-NGG PAM的前面，序列碱基与靶序列配对并调节Cas9在PAM上游约3bp处切割。需要指出的是，PAM序列必须在靶DNA位点之后，而不是在sgRNA中引导序列的一部分。

　　②sgRNA的构建与递呈。根据靶序列sgRNA可以通过含有表达原件的PCR扩增子或sgRNA表达质粒的形式递呈。基于PCR扩增子的sgRNA递呈在扩增时模板链必须带一个U6启动子。将扩增子与Cas9表达质粒pSpoCas9共转染细胞可以高效地获得所需sgRNA,并且可以很快地对细胞进行功能检测。通过sgRNA表达质粒递呈sgRNA也是一种简单、高效的方法，该方法只需要一些互补引物对sgRNA表达质粒进行单一的克隆。

　　③修复模板设计。传统上靶DNA的修饰需要以含有同源双臂的质粒作为修复模板，每个位点上的同源臂的长度超过500bp.这种方法主要用于产生大的修饰基因。最新 的ssODNs已经取代打靶修复质粒，可以用于短的修饰基因，作为特定靶位点修复模版，并获得很高的HDR效率。

　　④筛选单克隆细胞系。转染后通过流式细胞仪或连续稀释分离单个细胞便可得到，随后在细胞克隆期建立一个新的细胞系。

　　⑤功能检测。

　　对设计好的sgRNA进行活性检测以获得突变效率较高的sgRNA以用于后期的实验。目前主要采用的方法有限制性内切酶法、非配对内切酶法和SSA活性检测等方法。

　　3.3与其他基因组编辑技术的比较

　　近几年出现了许多基因组编辑技术，包括锌指核酸酶（ZFN）、TALEN及RNA指导的CRISPR/Cas核酸酶系统。前两种技术应用限制核酸内切酶催化结构域的策略来模块化DNA结合蛋白，并进一步诱导在特定基因组位点上目的DNA双螺旋的断裂（DSB）。与其他知名的核酸酶技术，例如：与ZFN、TALEN一样，Cas9能够刺激哺乳动物基因组中靶DNA在特定位点发生双链断裂及通过NHEJ和HDR刺激基因组编辑。与ZFN和TALEN技术相比较，Cas9具有几个潜在的优势：易于定制、更高的打靶效率和促进基因组多重编辑的能力。由于传统的ZFN通常很难设计，我们将主要比较Cas9和TALEN.

　　①易于定制。通过简单地购买一对寡核苷酸编码的20nt的一道序列，Cas9可以重新打靶新的DNA序列。与之相比，TALEN重新打靶新的DNA序列需要重新构建两个新的TALEN基因。虽然有很多的TALEN构建方案，但实际上构建一对新的TALEN需要更多的操作时间；②劈裂模式。化脓链球菌（S.pyogenes）Cas9在靶基因序列第17和18个碱基之间（PAM3bp5′）低效率的切割，使Cas9中RuvC或HNH其中的一个核酸酶结构域突变，可以使酶转化为DNA切割酶。与之相比，TALEN非特异性的切开一对TALEN之间12bp~24bp处的单体连接位点；③编辑效率。在多种不同类型的细胞核有机体中Cas9和TALEN均展现出促进基因组编辑效率的作用。然而这要归功于容易打靶，但Cas9可用于同时打靶多个基因组位点。

　　3.4 Cas9系统的局限性

　　Cas9可通过sgRNA上20nt的引导序列打靶特定的基因组位点。

　　Cas9打靶位点选择的唯一要求是PAM序列3′端20bp的靶序列的存在。每个Cas9直接同源，都含有唯一的PAM序列。例如，Cas9需要一段5′-NGG PAM序列，这种PAM的要求在人类基因组中并没有很严格的限制打靶的范围，这种打靶位点平均每8bp~12bp就会发现。除了打靶的范围，其他可能的限制是潜在的脱靶突变。

　　3.5 CRISPR/Cas9系统在基因组编辑中的应用

　　通过CRISPR/Cas9的特异性切割，可以对DNA分子进行定点编辑。 自2014年 以 来，CRISPR/Cas9系统的开发和应用已成为分子生物学的热点。CRISPR/Cas9技术已在细菌、果蝇、哺乳动物、斑马鱼和人多能干细胞（human pluripo-tent stem cell,hPSC）基因的功能性研究中得到应用。

　　Zhang C等[17]用CRISPR/Cas9对疟原虫基因进行了修饰，并介绍了一种对P.yoelii基因进行高效、准确敲除的方法。

　　Gokcezade G等[18]证明了在果蝇中通过双顺反的Cas9/sgRNA表达载体介导的CRISPR基因编辑是一种高效通用的方法，并通过单一质粒注射可以很大程度节省时间。

　　Ho T T等[19]通过敲除人体不同细胞中的非编码RNA,如mir-1,mir-29a,IncRNA-21A,UCA1和AK023948.证明了通过CRISPR/Cas9可以成功敲除人类细胞系中非编码的基因。

　　Sasaki H等[20]通过显微注射或电穿孔注射CRISPR/Cas9表达载体，成功敲除海鞘内源性基因。

　　Endo M等[21]为了验证CRISPR/Cas9是否可以敲除大米的旁系同源基因，通过同型sgRNA靶向诱变大米中的CDKA2、CDKB1和CD-KB2.结果证实同型sgRNA可以靶向诱变单倍体，二倍体和三倍体中的CDKA2、CDKB1和CDKB2基因。

　　Wei W等[22]通过向蚕胚胎中显微注射特异性的sgRNA和Cas9-mRNA介 导Bm-ck,BmK-MO,BmTH和Bmtam的突变，并通过带有Bmok基因飞蛾与野生型和两种带有Bmok基因相互杂交，检 测 其 后 代 突 变 率 达 到 了93.6%,证 明 了CRISPR/Cas9在家蚕中介导的基因编辑是可以遗传的。

　　Fan Z等[23]通过合成5个sgRNA（其中3个靶向识别不同的编码序列，一个识别KCNQ1,另一个识别PPP1R12C），证明了CRISPR/Cas9系统在介导仓鼠体细胞特定位点的突变中达到高效而准确的效果，并通过子核和胞质注射法对STAT2基因上的第4外显子进行了编辑。

　　Straub C等[24]利用CRISPR/Cas9成功敲除了Grin1基因，该基因编码NMDA受体，基本单位GLuN1,在鼠神经细胞中很少存在。并证明了CRISPR/Cas9可以介导体内神经元的断裂，为研究神经传导过程中的特异蛋白功能提供了有利的方法。

　　随着CRISPR/Cas9技术日渐成熟，为基因疾病的治疗提供了更方便、高效的工具。

　　Lin S R等[25]为证明CRISPR/Cas9系统是否能断裂乙型肝炎病毒（HBV）基因组，他们设计8个可识别A基因型HBV的gRNA,伴随gRNA的CRISPR/Cas9系统可以减少HBV的核心复制和蛋白质的合成，其中一个gRNA可以打靶不同基因型的HBV病毒，最后通过感染的HBV小鼠模型，更加证明了系统可以清除体内HBV,结果可以降低血清中抗原水平。

　　自第1只基因敲除小鼠模型的产生，科研工作者致力于模型生物的构建，但传统的构建方法费时费力，程序繁琐，新一代的CRISPR/Cas9技术为构建模式生物提供了新的平台。

　　Edvardsen R B等[26]在大西洋鲑鱼中通过CRISPR/Cas9系统靶向修饰tyr和slc45a2基因，第一次成功地在冷水海洋物种中运用CRISPR/Cas9成功靶向诱变，并成功获得突变的等位基因，证明了F0代可用于大西洋鲑鱼的功能性 研 究。

　　Irion U等[27]在斑马鱼中成功利用CRISPR/Cas9获得功能缺失的等位基因。通 过CRISPR/Cas9高效而且准确的靶向识别修饰alb基因上的终止密码子，突变率达到50%并可以通过生殖细胞遗传给下一代，为遗传研究提供了生物模型。该研究也证明了通过CRISPR/Cas9系统可以为脊索动物的内源性基因的研究提供合适的模式生物。Ni W等[28]利用CRISPR/Cas9系统成功敲除山羊的成纤维细胞基因，并通过核移植获得了一代基因突变山羊。

　　Xing H L等[29]人开发出一种基于PC-AMNIA或PGreen载体的CRISPR/Cas9双运载体和sgRNA模式载体作为一种植物多基因编辑工具。这种载体可以瞬时稳定地使CRISPR/Cas9系统表达并在植物中进行高效率的靶向突变。

　　4展望

　　随着人类基因组测序的完成和全基因组测序技术的不断发展，复杂基因组中未知基因功能的探索已成为后基因时代的热点。与传统的基因打靶技术相比，新一代的人工核酸酶ZFN、TALEN和细菌获得性免疫系统CRISPR可以应用于更多的物种，且定向修饰更加精确，效率更高，所需时间更短，得到的突变可以通过种系遗传。但是新一代的基因编辑技术还处于初级阶段，还存在细胞毒性、构建复杂、价格昂贵和脱靶效应等问题。总而言之，新一轮基因组编辑技术虽然处于研究的初期阶段，但其在基因编辑方面已表现出巨大的潜力和广阔的应用前景，在未来的发展中，基因编辑技术必将成为生命科学和生物医学等领域研究与应用的重要工具。