外源基因转入液体悬浮培养烟草细胞的新方法

　　烟草BY2细胞(Bright Yellow2,BY2)是非常重要且用途广泛的细胞系.由Kato等于1972年分离得到.此外,BY2细胞系具有高度的同一性,生长迅速,可获得具高度同周期性的BY2细胞,1周内便可增加80~100倍.因此,BY2细胞已是生物研究的模式系统.

　　目前对于BY2细胞的有效利用大多局限于生化物质对其生长的影响以及利用此模式系统进行烟草细胞一些代谢物质的研究及生产,而鲜有将外源基因转入BY2细胞并进行研究,本文通过以烟草细胞的外源基因p35S启动子和绿色荧光蛋白(GFP)为例,介绍一种快速简便的将外源基因转入液体悬浮培养的烟草细胞的方法.

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　实验室自有液体悬浮培养烟草BY2细胞,27℃,130r·min-1,暗培养.

　　p35S:GFP表达载体为实验室自有表达载体,已通过基因测序和酶切验证.

　　1.2 培养基和试剂

　　1.2.1 烟草BY2细胞培养基 液体:MS盐,100mg·L-1;肌醇1mg·L-1;盐酸硫胺素200mg·L-1;磷酸二氢钾0.2mg·L-1;2,4-D 2mg·L-1;甘氨酸30g·L-1;蔗糖;30g·L-1,pH值为5.8,120℃高温高压灭菌20min后使用.固体:在液体悬浮培养烟草BY2细胞培养基的基础上加入琼脂粉,使其浓度为1%,120 ℃高温高压灭菌20min后使用.

　　1.2.2 试剂 1mL10mM MgSO4,200mM As.

　　2 方法

　　2.1 p35S:GFP表达载体转入农杆菌 将实验室自有p35S:GFP表达载体采用热激转化的方法转入农杆菌GV3101,农杆菌GV3101感受态为实验室自有,并对农杆菌阳性克隆进行阳性克隆的筛选和鉴定.转化方法详见参考文献.

　　2.2 p35S:GFP表达载体转入BY2细胞
　　
　　2.2.1 p35S:GFP表达载体转入液体培养的BY2细胞
　　a.将鉴定正确已经转入p35S:GFP表达载的农杆菌GV3101阳性克隆进行划板并挑取单克隆进行小型摇培(4mL),为进行转基因操作做准备.

　　b.从小型摇培的农杆菌菌夜吸取100微升于加有硫酸卡那霉素、利福平、庆大3种抗生素的2mL LB培养基中,250r·min-1,28℃过夜直至OD600至0.6.

　　c.洗农杆菌:取1mL农杆菌菌液于室温条件下2 500g离心10min,弃上清,加入1mL 10mM Mg-SO4,用移液器吸打混匀,室温2 500g离心10min,弃上清,加入1mL 10mM MgSO4,用移液器吸打混匀,加入2μL 200mMAs用移液器吸打混匀(利于转化,也可选择不加),静置2h,室温.

　　d.分装悬浮培养的烟草BY2细胞5mL于4个高温高压灭菌的培养皿中,用移液器吹打30次,以诱导缺口,有利于基因转化效率的提高(同时做几个平行实验以防染菌).

　　e.在3个培养皿中加入100μL处理好的农杆菌并轻轻摇匀,在另一个培养皿中加入100μL升ddH2O作为对照组.

　　f.28℃静置,暗培养48h.

　　2.2.2 将转基因的BY2细胞转入固体培养基
　　a.在4个培养皿中各加入5mL液体培养基并轻轻摇匀.

　　b.转入50mLEP管,用液体培养基补充到总体积为35mL.

　　c.室温1 000g离心5min.

　　d.小心弃去上清,均匀倒在含有50μg·mL-1潮霉素和万古霉素的固体培养基平板上.

　　e.28℃静置暗培养3周.

　　2.2.3  阳性克隆细胞团的筛选

　　转基因BY2细胞转化后约3周可在50μg·mL-1的潮霉素和万古霉素抗性平板上长出阳性单克隆的细胞团,万古霉素可起到抑制农杆菌生长的作用,而潮霉素可起到筛选阳性克隆细胞的作用.将所筛选到的阳性单克隆细胞团转移出至新的含有50μg·mL-1的潮霉素抗性平板上传接一代再转接至液体培养基传代培养.如图1所示:【图1】

　　
　　3 结果

　　3.1 荧光观察

　　通过激光共聚焦荧光显微镜对非转基因即野生型(WT)BY2细胞和转基因型BY2细胞的荧光观察发现,野生型即非转基因BY2细胞有着极其微弱的自发荧光,几乎看不到,但是转基因BY2细胞的荧光要很强,且远远强于野生型BY2细胞(图2).【图2.略】

　　3.2 RT-PCR鉴定表达载体的表达情况

　　对转基因BY2细胞和非转基因BY2细胞进行RNA提取并进行发转录,经过RT-PCR鉴定,结果证明非转基因BY2细胞即野生型BY2细胞中并无GFP的表达,而转基因BY2细胞中表达很强(图3).【图3.略】
　　
　　4 讨论

　　液体悬浮培养烟草细胞系培养操作简单,传代培养接种方便快捷,可在4~5d传接培养一次,这给实验带来了极大的方便,有效的的缩短了实验材料的培养时间,使实验周期大大缩短.另外近些年在转基因植物中要提高外源基因的表达效率是一项比较复杂的工作,而在烟草这种模式植物中,转基因的效率是相对稳定的,液体悬浮培养的BY2细胞生命周期短,转接传代操作简单,可随时取材进行观察,省去植物种植的时间.

　　本文通过以p35S:GFP表达载体转入BY2细胞为例证明了本方法可以将烟草细胞的外源基因转化进入液体悬浮培养的BY2细胞,并得到稳定表达.随着现代分子生物学和基因工程技术的发展,更多有用的基因被克隆和鉴定,目前存在许多转化率低,转化植株后代遗传不稳定等问题.烟草悬浮细胞转基因手段缩短实验周期,提高了材料的获得率和筛选效率.通过我们对实验方法作出的一些改进,相信此方法将使液体悬浮培养烟草细胞系的利用得到大大的提高,使液体悬浮培养烟草细胞系的应用性更广,前景可观.
　　
　　参考文献
　　
　　[1]WU Yingying,WILLIAMS M,BERNARD S,et al.Functional identification of two nonredundant Arabidopsis alpha(1,2)fucosyltrans-ferases specific to arabinogalactan proteins[J].The Journal of Biological Chemistry,2010,285(18):13638-13645.
　　[2]LEE Chanhui,ZHONG Ruiqin,YE Zheng-hua.Arabidopsis family GT43members are xylan xylosyltransferases required for the elonga-tion of the xylan backbone[J].Plant & Cell Physiology,2012,53(1):135-143.
　　[3]Kato K,Matsumoto T,Koiwai S,et al.Liquid suspension culture of tobaco cells[M].Osaka:Society of Fermentation Technology,1972:689-695.
　　[4]GUAN Xin,BUCHHOLZ G,NICK P.The cytoskeleton is disrupted by the bacterial effector HrpZ,but not by the bacterial PAMPflg22,in tobacco BY-2cells[J].Journal of Experimental Botany,2013,64(7):1805-1816.
　　[5] 吴科瀛,梁玉玲.烟草BY2细胞培养及盐胁迫研究[J].畜牧与饲料科学,2009,30(4):8-9.