二硫键蛋白表达策略的研究新进展

　　蛋白质在细胞的各种生命活动中扮演了重要的角色，如信号传导、免疫应答、细胞粘附等。20世纪 70 年代，DNA 重组技术的应用，使蛋白质能在多种宿主细胞中表达[1].总体上，高产率重组蛋白的获得比较困难且不可预计，尤其是目标蛋白存在翻译后修饰，如形成二硫键。真核生物内的二硫键蛋白普遍存在，对人类基因组的预测表明，大约 30%的蛋白定位于内质网，而其中一半数量含有二硫键[2].二硫键可在构象上固定多肽链的骨架或改善其热动力学稳定性，以抵抗高温、强酸、强碱等伤害。因此，二硫键蛋白常被分泌到细胞外或锚定于细胞膜，它们适于作为治疗药物（如胰岛素、抗体）或制药产业的靶标蛋白[3].工业化生产及科学研究也需要大量的活性蛋白。

　　真核细胞（酵母、昆虫、中国仓鼠卵巢细胞）表达二硫键蛋白，时间长且花费大，而无细胞表达体系难以实现扩大化生产。大肠杆菌是目前首选宿主菌之一，因其具备生长快、操作简单、产量高等特点备受人们青睐[3].大肠杆菌中二硫键蛋白的形成定位于细胞周质，但蛋白产率低。而大肠杆菌细胞质缺乏真核蛋白表达所需的翻译后加工机制，因此多数二硫键蛋白在细胞质中形成包涵体。

　　蛋白包涵体只能通过变性、复性等过程获取一定比例的活性蛋白，且方法繁琐、产率低下、通用性不强。因此如何改善大肠杆菌细胞的表达环境以获得高产率的活性二硫键蛋白，是科学家们致力于解决的难题。本文介绍了大肠杆菌中二硫键的形成机制，并综述近年来二硫键蛋白表达策略的最新研究成果，为富含二硫键蛋白在大肠杆菌反应器的重组表达或工业化生产提供理论基础。

　　1 大肠杆菌细胞周质二硫键的形成

　　1.1 周质蛋白分泌机制

　　多数大肠杆菌分泌蛋白首先被合成蛋白前体。它们的信号肽由 Sec 分子识别，根据信号肽的种类，Sec 机制分为翻译后和共翻译转运两种方式。在前者，细胞质内的伴侣分子 SecB 与前体蛋白结合，并维持蛋白的未折叠状态直至接触移位酶。而共翻译转运方式是在翻译过程中蛋白的信号肽由信号识别颗粒 （signal recognition particle,SRP）识别，整个 SRP-核糖体-新生多肽复合物再与 Sec 移位酶结合[4].少数分泌蛋白采取一种双精氨酸转运系统 （twin arginine translocation system,Tat），该系统转运蛋白的信号肽带有特征性双精氨酸基序。与 Sec 机制不同，Tat 系统中蛋白以紧密折叠形式经过细胞膜。该系统可能与细菌产生抗生素耐药性有关[4].
　　
　　1.2 DsbA/DsbB 氧化系统

　　转运至细胞周质的多肽由 Dsb 蛋白（Ds-bA- DsbG）催化形成二硫键。肽链半胱氨酸的硫醇盐阴离子首先亲和攻击 DsbA 的活性中心，并与DsbA 形成分子间二硫键中间体。该中间体很不稳定，由肽链另一个硫醇盐阴离子亲和攻击而快速释放，肽链形成二硫键，DsbA被还原[5].

　　还原态 DsbA 经 DsbB 的重新氧化实现活性再生，而 DsbB 则通过电子传递系统再被氧化。DsbB 是细胞内膜蛋白，它具有 4 个跨膜螺旋的核心区和两段暴露于细胞周质的柔性区。DsbB有两对二硫键，其柔性区的二硫键首先从 DsbA 获得电子，再传递给跨膜区附近的半胱氨酸对[6].该对二硫键被还原后，其中一个半胱氨酸可与辅因子醌的芳环形成电荷传递复合体。有氧条件下，电子经细胞色素 bo、bd 氧化酶传递给氧气分子，而缺氧时，电子的最终受体改变，由甲基萘醌将电子传给延胡索酸或硝酸盐等[7]（图 1）。

　　1.3 DsbC/DsbD 异构化系统
　　
　　DsbA 参与二硫键形成反应是快速且非特异的，它倾向于催化顺序排布的半胱氨酸对形成二硫键。因此蛋白存在多对非连续性二硫键时，就容易发生错误配对，其在细胞内积累或被降解[9].大肠杆菌存在相应的纠错机制-周质中的二硫键异构酶 DsbC,可识别并帮助错误折叠蛋白恢复自然状态。

　　体内的 DsbC 是两个亚基组成的同源二聚体，整体呈 V 形。每个亚基具有二聚体化和硫氧还蛋白两个功能域，它们依靠一段短的螺旋区连接。DsbC 共有 4 个半胱氨酸，硫氧还蛋白功能域C 端的两个半胱氨酸形成二硫键，稳定 DsbC 的空间结构[10].N 端的半胱氨酸对是 DsbC 的活性中心，它们具有 CXXC 催化模序，并由 DsbD 维持还原状态。DsbD 是细胞内膜蛋白，它包含 3 个模块：跨膜功能域 DsbDβ，细胞周质功能域 DsbDα 和 Dsb-Dγ。每个功能域有一对活性半胱氨酸。DsbDβ 的半胱氨酸对首先从细胞质硫氧还蛋白获取电子，再传递到 DsbDγ 功能域，然后经 DsbDα 最终将电子传递给 DsbC[11]（图 1）。DsbD 及其家族蛋白是目前已知的一类将电子从细胞质膜传递到细胞周质的氧化还原酶。

　　事实上，DsbC 并不是 DsbD 的唯一底物。

　　DsbG 为 DsbC 的同源类似物，它具有 CXXC 催化模序，由 DsbD 维持还原态。最新研究发现[12],除了异构酶活性，细胞周质的 DsbG 还发挥还原酶作用。某些周质蛋白存在单一半胱氨酸，它们暴露于氧自由基环境易生成次磺酸，或被进一步氧化成磺酸而损害蛋白活性。DsbG 表面的负电荷区域适于识别已折叠蛋白，并作为周质还原系统的关键因子防止蛋白的单一半胱氨酸遭受氧化损伤。而DsbC 内部排列的疏水氨基酸，似乎更利于它与未折叠蛋白作用并纠正错配二硫键。另外，DsbC 也可作为 DsbG 功能的替补[12].