分子生物学论文
2 大肠杆菌细胞质二硫键的形成
2.1 野生型菌株细胞质的还原途径
大肠杆菌细胞质的还原环境不利于蛋白的氧化。Derman 等[13]的开创性工作首先阐明了大肠杆菌细胞质中两条主要的还原途径。一条是硫氧还蛋白途径：包括硫氧还蛋白 TrxA 和 TrxC,并由硫氧还蛋白还原酶 TrxB 维持还原态；另一条是谷氧还蛋白途径：其核心是谷胱苷肽还原酶（Glu-tathione reductase），它能还原 GshA 和 GshB 两种酶，这两类酶与细胞质还原型谷胱甘肽（glu-tathione, GSH）的形成有关。在细胞质中，GSH 可直接参与二硫键的还原反应，它首先与底物形成中间体复合物，再由一种谷氧还蛋白（Grx1, Grx2,Grx3）使中间体释放，生成还原态底物和氧化态谷氧还蛋白，后者又在 GSH 作用下重新恢复还原态[14].两条电子传递网络的还原电势均来自细胞质 NADPH 池[8]（图 2）。
2.2 突变菌株细胞质的氧化途径
在研究野生型菌株细胞质还原途径时，Der-man 等[13]发现，同时缺失两个核心基因 trxB 和 gor的菌株无法存活，但这种致死性可被细胞质内过氧化物酶 AhpC 突变抑制。AhpC*突变体具有二硫键还原酶活性，它能在细胞质中富集还原态Grx1,保证菌株活力[15].trxB 的缺失使细胞质内氧化型硫氧还蛋白 TrxA、TrxB 积累，它们可催化形成二硫键。此突变株被称为 F魡113 （trxB, gor, ah-pC*）[8],商业名称是 Origami.利用 Origami 使胶原4-脯氨酰羟化酶在细胞质的表达量远高于野生型 BL21 的细胞周质[16].此外，该氧化型细胞质也用于富集功能性脂肪酶 B、神经生长素的 Ig2 功能域及几丁质酶等[17].（trxB-, gor-） 菌株虽然可实现蛋白的氧化折叠，但其细胞质缺乏二硫键异构化途径。Bessette等[18]
研究发现，DsbC 在细胞质过量表达可有效提高二硫键蛋白的活性产率。在体外的无细胞体系，它也有同样效果[19].受此启发，2012 年，Lobstein等[3]
基于（trxB-, gor-）菌株，将 dsbC 基因插入严格控制的细菌 rRNA 转录启动子 rrnB 下游，使 DsbC在细胞质稳定且过量表达，改造菌株命名为SHuffle（图 3）。他们比较了 3 种多二硫键蛋白：荧光素酶（Gaussia luciferase, Gluc）、尿激酶、组织纤溶酶原激活物 （tissue plasminogen activator, vtPA）在 SHuffle 中的表达活性，认为该菌株促进蛋白折叠具有底物特异性。但 SHuffle 仍成为表达二硫键蛋白的新选择，如 Tait 等[20]利用 SHuffle 表达人疱疹病毒膜蛋白 U24,其产量可比普通的 BL21（DE3）细胞提高 4.3 倍。
2.3 DsbC 在蛋白二硫键折叠中的研究
在细胞质或周质中表达二硫键蛋白是否需要DsbC 的辅助，这与二硫键的形成机制有关。在细胞周质，DsbA 首先向未折叠多肽引入二硫键，它倾向于催化顺序排布的半胱氨酸对的氧化。比较而言，（trxB-, gor-） 突变体细胞质的二硫键形成机制尚不明确。但与周质中未折叠多肽不同，Kramer等[21]报道核糖体可促进新生肽链形成二级结构，合成蛋白在核糖体通道出口处或已存在部分折叠。这利于氧化酶催化肽链形成正确的二硫键，因而降低了细胞质蛋白折叠对 DsbC 的依赖。这似乎可解释尿激酶在细胞周质表达时的活性完全依赖 DsbC,而在细胞质表达对 DsbC 的依赖性仅为50%[8].
DsbC 在某些情况下对细胞质蛋白表达非常有利。例如，G 蛋白偶联受体（G protein-coupled re-ceptors, GPCRs） 是最着名的药物靶标分子家族，一直以来备受科学家关注。B 类 GPCR 的细胞外功能域（extracellular domain, ECD）包含 3 对保守的二硫键，为蛋白的获取及结构解析带来了较大困难。2008 年，Pioszak 等[22]将人类甲状旁腺素受体的 ECD 构建到 MBP 融合体系，并与 DsbC 在Origami 细胞质内共表达。然后利用目标蛋白与DsbC 在体外谷胱甘肽缓冲液中孵育，进行蛋白二硫键重排反应。他们最终获得正确折叠的样品，解析出该蛋白结构。随后，利用此体系他们先后成功表达了皮质激素释放因子受体[23]和垂体腺苷酸环化酶受体[24].
3 多二硫键蛋白在大肠杆菌中的表达策略
随着大肠杆菌细胞中二硫键形成机制的深入揭示，很多理论广泛应用于真核生物二硫键蛋白表达。特别是近年来人们不断探寻新的方法和体系，使大肠杆菌表达多二硫键蛋白的研究取得了较多成果。
3.1 分子伴侣辅助二硫键蛋白折叠一般地，肽链经过疏水塌缩、空间盘曲、侧链聚集等折叠过程形成其天然构象。二硫键的形成和肽基脯氨酰键异构化是其中的限速步骤。经典的"自组装学说"认为，肽链氨基酸序列包含了蛋白折叠所需的全部信息。随着研究深入，Ellis[25]的"辅助性组装学说"提出体内肽链的折叠需要分子伴侣的辅助。分子伴侣可为二硫键形成等限速步骤提供较长的折叠时间，促进蛋白组装成自然状态。
3.1.1 周质分子伴侣辅助二硫键蛋白表达
细胞周质的分子伴侣包括 FkpA、Skp、DegP、SurA 等。FkpA 是一类通用的折叠增强子，兼具分子伴侣与肽基脯酰胺顺反异构酶 （peptidyl-propylcis-trans isomerase, PPIase）活性。它是 V 型的同源二聚体，每个亚基的 N 端参与二聚体化或具有分子伴侣活性，C 端为 PPIase 功能域。FkpA 以二聚体界面形成的疏水口袋结合底物，并促进柔性 C端接近底物脯氨酰键[26].它的 PPIase 活性催化某些稳定的反式肽基脯氨酰键，异构成功能蛋白所必需的顺式构型。目前已发现的 PPIase 分属于 3个蛋白家族：亲环素、FK506 结合蛋白以及细小菌素蛋白[4].
SurA 与细小菌素蛋白类型的 PPIase 具有同源性，它最早从细菌抵抗饥饿胁迫中被鉴定。SurA的空间构象赋予其分子伴侣活性。它的外形类似非规则的哑铃状，其核心模块有一个较深的口袋，偏爱识别含 Ar-X-Ar 基序的底物。Ar 指芳香族氨基酸，X 指任意氨基酸[26].其余分子伴侣，如 Skp通常捕获由 Sec 分泌机制转运的未折叠多肽。
DegP 是 HtrA 丝氨酸蛋白酶家族的第一位成员，它用于清除细胞周质变性或聚集蛋白，其分子伴侣或蛋白酶活性受温度调控[26].
因细胞周质独特的氧化环境，可将某些二硫键蛋白分泌于周质中表达。但是分泌效率的不可控性以及周质 Dsb 蛋白、分子伴侣含量偏低，带来了活性蛋白产量不高等问题。在过表达的分子伴侣协助下，蛋白折叠效率增加，活性产率可能提高。2011 年，Schlapschy 等[27]将 FkpA、SurA 以及DsbA、DsbC 共同构建成新型辅助质粒 pTUM4,使4 种折叠酶在细胞周质中过表达，提高了分泌蛋白的折叠效率。另外，筛选提升目标蛋白分泌效率的菌株类型也是必要的，如 JM83、HM125、KS272等。Schlapschy 已利用 pTUM4 辅助了多种二硫键蛋白的表达，包括恶性疟原虫表面蛋白 48/45,树突细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合的非整合素以及各种抗原结合片段等[27].
3.1.2 细胞质分子伴侣增加二硫键蛋白可溶性
相比细胞周质，大肠杆菌细胞质中存在更多的分子伴侣，与折叠相关的分子伴侣系统包括三类[26]:触发因子（trigger factor, TF）、DnaK-DnaJ-GrpE 和GroEL-GroES.细胞质中，短的新生多肽首先与核糖体结合的 TF 相互作用，随着肽链延伸，长链多肽由 DnaK 捕获。DnaK 的 N 端功能域水解 ATP供能，协助 C 端完成多肽的折叠。共伴侣素 DnaJ可上调 DnaK 的 ATP 酶活性，而增强 DnaK 与底物的结合力。另一共伴侣素 GrpE 通过催化 ATP/ADP 交换反应介导底物释放。除非底物已完成折叠，否则它可能将被传递给下游的 GroEL-GroES系统。GroEL 与共伴侣素 GroES 形成"折叠笼"结构[28],为底物进一步折叠提供良好的环境。
在大肠杆菌细胞质，多数重组蛋白受控于强启动子，它们的表达水平通常较高。但宿主细胞自身的分子伴侣含量或许无法满足新生肽链正确折叠的需求，导致目标蛋白可溶性降低，甚至形成包涵体。共表达分子伴侣可能有效辅助二硫键蛋白折叠，增加蛋白可溶性。例如，Kyratsous 等[29]设计DnaK 与 GroEL 的融合载体，在大肠杆菌细胞质中获得了鼠类朊蛋白的可溶产物。另外，共表达DnaKJ 可防止镁离子转运蛋白 CorA 形成包涵体[30],或提高人类粒系集落刺激因子（human granulo-cyte colony stimulating factor, hG-CSF）在细胞周质的表达量[31].
3.2 融合标签辅助二硫键蛋白表达
除了分子伴侣，利用 Dsb 蛋白与目标蛋白融合表达，也可促进二硫键正确形成。目前，已有包含 Dsb 蛋白的商业化载体供选择，如 pET-39（Ds-bA）、pET-40（DsbC）。另外，一些细胞质融合标签，如 MBP（maltose-binding protein）、NusA（N-Utiliza-tion substance）、TRX（thioredoxin）等也被广泛使用。
MBP 由大肠杆菌 K12 的 malE 基因编码，它能增加融合蛋白的溶解性。而且 MBP 不含半胱氨酸，避免了与目标蛋白半胱氨酸形成错配二硫键的问题。MBP 已成功应用于真核细胞蛋白以及人工合成的单链抗体 （single-chain antibody fragment,scFv）的可溶表达[32].Houry 等[33]揭示 NusA 是分子伴侣 GroEL 在体内的必须底物。所以NusA 可能招募分子伴侣帮助蛋白折叠。另一种 TRX 标签可防止细胞质蛋白聚集沉淀，甚至挽救错折叠的多二硫键肽链，如槲寄生毒素、猪胃蛋白酶原 A[17]等。TRX 维持蛋白稳定性的机制尚不清楚，但它可能依赖伴侣活性辅助 scFv 的折叠，理由是突变其催化中心的半胱氨酸，它仍能促进活性 scFv 的表达[17].
3.3 二硫键从头形成体系促进蛋白表达
自然界中二硫键的形成可以在三类细胞内隔室中完成，真核细胞内质网、线粒体内膜空间以及原核细胞的细胞周质。相对于这些细胞隔室，大多数野生型原核细胞质几乎观察不到二硫键蛋白的存在。Derman 等[13]通过（trxB, gor, ahpC）的突变，首先实现了大肠杆菌细胞质内生产二硫键蛋白。
在（trxB-, gor-）工程菌中，细胞质硫氧还蛋白参与硫醇-二硫键的交换反应，即它依靠还原底物（如核苷酸还原酶）而将二硫键转移到其他蛋白（如碱性磷酸酶）中，硫氧还蛋白本身不能催化二硫键从头形成。所以 Origami 等生产的蛋白实为某些代谢途径的副产物，蛋白产率普遍偏低[34].