人VIGILIN蛋白的基因分段表达

　　人高密度脂蛋白结合蛋白（HDLBP）-VIGILIN蛋白是一种含有14个相关、但不完全相同的串联的KH结构域的多功能蛋白质，VIGILIN蛋白在细胞核和细胞质中均有分布[1].VIGILIN蛋白家族广泛存在于真核生物中，如果蝇中的DDP1、酵母中的Scp160、脊椎动物中的VIGILIN蛋白。不同生物种类中的VIGILIN蛋白结构和功能具有高度的保守性[2,3].人VIGILIN基因位于2q37,其包含29个外显子，主要编码相对分子质量为150×103的VIGILIN蛋白。目前有研究报道VIGILIN蛋白有多种生物学功能，包括参与脂代谢[4]、有丝分裂时异染色质的分离、维持异染色质结构的稳定性[5],帮助tRNA在细胞质和细胞核间的转运、维持mRNA的稳定性[6],参与印记基因IGF2/H19的调控[7],与肝癌、乳腺癌等的发生、发展有关[8,9].

　　本研究根据人VIGILIN蛋白不同的结构域将VIGILIN全长分成5个片段，并且将5个片段分别亚克隆到pGEX 5X3原核表达载体中，采用pGEX原核表达系统在大肠杆菌中诱导表达，产生大量GST融合蛋白，为进一步研究VIGILIN与其他蛋白的相互作用打下基础。

　　1材料与方法

　　1.1实验材料2×Taq Plus Master Mix购自上海近岸科技有限公司，Pyrobest DNA Polymerase购自大连宝生物公司，质粒小量提取试剂盒购自Omega公司，DNA凝胶回收试剂盒购自QIAGEN公司，限制性内切酶及DNA连接酶购自Formentas公司，IPTG、琼脂糖购自Invitrgen公司，引物合成及质粒测序鉴定由Invitrogen公司完成。含VIGILIN全长cDNA序列的pDsred2-N1/VIGILIN重组质粒由我室构建，原核表达载体pGEX 5X3由刘建余博士馈赠，大肠杆菌BL21、DH5α为本室保存。

　　1.2 VIGILIN分段及引物设计根据人VIGILIN蛋白不同的结构域将VIGILIN全长cDNA（GenBankNM_005336.4）分成5个片段，分别为N端、KH1-7、KH8-12、KH13-14、C端，并用primer软件设计包括全长在内的6对引物，分别在引物两端加上合适的酶切位点及酶切位点相应的保护碱基，送至Invitrogen公司合成。

　　为了纠正与GST融合表达后可能出现的读码框移位，设计及合成引物时在VIGILIN全长cDNA起始密码上游引入2个碱基，在N端、KH13-14、C端端上游引入2个碱基，在KH1-7、KH8-12上游引入1个碱基，以使GST和VIGILIN都能在正确的读码框内融合表达。分段扩增VIGILIN片段的引物序列、位置、酶切位点等见附表。

　　1.3 VIGILIN全长及分段cDNA PCR扩增以pDsred2-N1/VIGILIN重组质粒为模板扩增VIGILIN全长cDNA及分段cDNA.

　　VIGILIN全长PCR扩增的反应体系为：10×Pyrobest buffer 5μL,dNTP Mix（各2.5mmol/L）4μL,上游引物（10pmol/L）1μL,下游引物（10pmol/L）1μL,模板0.5μL（约50ng），Pyrobest酶（5U/μL）0.5μL混匀，水36.5μL,反应总体积为48.5μL[10].

　　VIGILIN全长扩增条件为：预变性94℃，5min,变性94℃，45s,退火58℃，30s,延伸72℃，3min,30个循环后4℃保存。

　　VIGILINN端、KH1-7、KH8-12、KH13-14、C端PCR扩增体系为：2×Taq Plus Master Mix25μL,上游引物（10pmo l/L）1μL,下游引物（10pmol/L）1μL,模板0.5μL（约50ng），水22.5μL,反应总体积为50μL.VIGILIN分段扩增条件为：预变性94℃，1min 30s,变性94℃，30s,退火温度见附表，30s,延伸72℃，1min,30个循环后72℃延伸5min后4℃保存。各段均以相应体系和相应条件分别扩增4管，共200μL.分别取各段扩增产物5μL,15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定后各段剩余PCR产物均用15g/L琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段。

　　1.4 VIGILIN全长及分段cDNA原核表达载体构建分别双酶切VIGILIN各片段及pGEX 5X3质粒。各片段所用限制性内切酶分别为SmaⅠ/XhoⅠ（VIGILIN全长），BamHⅠ/EcoRⅠ（N端），EcoRⅠ/XhoⅠ（KH1-7），EcoRⅠ/XhoⅠ（KH8-12）,BamHⅠ/XhoⅠ（KH13-14），BamHⅠ/EcoRⅠ（C端）。pGEX 5X3质粒用相同的限制性内切酶双酶切。将酶切后的各片段用15g/L琼脂糖凝胶电泳后回收。分别将纯化的目的片段与纯化的相应的pGEX 5X3载体连接，VIGILIN分段的连接体系为：10×T4DNA ligase buffer 2μL,T4DNA ligase（5U/μL）0.2μL,pGEX5X3载体20ng,目的片断60~200ng,总体积20μL.

　　22℃连接1h.VIGILIN全长因引入了SmaⅠ,所以按平末端的方法连接，体系为:0×T4DNA ligasebuffer 2μL,50%PEG 4000Solution 2μL,T4DNA ligase（5U/μL）1μL,总体积20μL.

　　22℃连接2h.其中载体DNA与插入片段DNA的摩尔比为1∶（3~10）。取各连接产物5μL,转化DH5α感受态细胞，然后铺于LB（100μg/mL氨苄青霉素）平板上，待菌液干后翻板，37℃过夜，次日挑单菌落接种至LB液体培养基中过夜培养，扩增后按质粒小量提取试剂盒说明书提取重组质粒，分别按附表中各片段的限制性内切酶双酶切各重组质粒筛选出阳性克隆。将阳性克隆菌各取300μL送至公司测序，测序均用pGEX通用引物。测序后将测得的序列与VIGILINcDNA全长序列用DNAman软件比对。将鉴定好的重组质粒转化到E.coli BL21大肠杆菌中鉴定：经酶切VIGILIN6个PCR产物及pGEX 5X3载体、连接相应的PCR产物及载体、转化连接产物到大肠杆菌中后，各随机挑取单个菌落进行扩增培养，然后提取质粒进行双酶切后，用10g/L琼脂糖凝胶电泳。

　　1.5 GST融合蛋白表达条件的优化（以GST-VIIGLIN N为例）以不同条件分别对GST-VIGILIN N融合蛋白进行诱导表达后，用SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的表达情况。

　　GST-VIGILIN N融合蛋白按培养温度（16℃、25℃）,IPTG浓度（0.1、0.5、1.0mmol/L），诱导时间（3h、6h）的不同条件分别进行诱导表达。诱导3h、6h后各分别取出3mL培养物，10 000r/min,离心1min后弃上清，沉淀在-20℃冰箱中反复冻融2次后分别向沉淀中加入300μL细菌裂解液，冰上以150W,超声4s、停12s的条件超声10次后，4℃、12 000r/min离心10min.分离上清和沉淀，向沉淀中加入300μL 1×SDS上样缓冲液，上清各取80μL加入20μL 5×SDS上样缓冲液混匀，100℃煮5min,各取20μL用100g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，确定最适表达条件。

　　GST-VIGILIN全长融合蛋白按培养温度（16℃、25℃）,IPTG浓度（0.1、0.5、1.0mmol/L），诱导时间（3h,6h,12h）诱导，其余方法同前，进行优化[11].

　　1.6 GST-VIGILIN全长及分段重组克隆融合蛋白表达按上述优化条件诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白，诱导后行SDS-PAGE电泳并用抗GST的抗体做Western blot检测融合蛋白的表达。取保种的经鉴定后构建成功的各pGEX 5X3-VIGILIN重组菌划板，次日挑单克隆于10mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振摇过夜，取100μL菌液加入10mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、220r/min,快摇2h,至对数期（吸光度600约为0.6）.

　　VIGILIN分段加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L,25℃，150r/min诱导表达3h[11].VIGILIN全长加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L,16℃，150r/min诱导表达12h.取各段诱导后菌液1mL,4℃，10 000r/min离心1min弃上清，收集菌体，各加入100μL 1×SDS上样缓冲液，沸水煮10min后瞬时离心，上清用于SDS-PAGE电泳及Western blot检测融合蛋白的表达。

　　2结果

　　2.1 VIGILIN各片段的PCR扩增以pDsred2-N1/VIGILIN重组质粒为模板扩增VIGILINcDNA1的理论大小分别为：

　　N端，455bp;KH1-7,1 480bp;KH8-12,1 231bp;KH13-14,412bp;C端，242bp.

　　如图1所示，各片段经电泳后呈现为清晰的单一条带，大小与理论值大致一致。

　　2.2 pGEX 5X3-VIGILIN各段重组质粒的鉴定各酶切后的重组质粒分别可见约5 000bp的质粒，3 800bp左右的VIGILIN全长、450bp左右的N端、1 500bp左右的KH1-7、1 200bp左右的KH8-12、400bp左右的KH13-14、250bp左右的C端。见图2.大小与理论值大致一致，测序结果比对后证实与目的片段完全一致。

　　2.3 GST-VIGILIN融合蛋白表达条件的优化如图3所示：

　　GST-VIGILIN N分段融合蛋白在IPTG浓度为0.1mmol/L,温度为25℃,诱导时间为3h和IPTG浓度为0.1mmol/L,温度为16℃,诱导时间为6h时分布在裂解液上清较多，两者上清中蛋白量相差不大，为了节约时间，最终选择以IPTG浓度为0.1mmol/L,温度为25℃,诱导时间为3h作为分段融合蛋白的表达条件。

　　GST-VIGILIN全长融合蛋白在IPTG浓度为0.1mmol/L,温度为16℃,诱导时间为12h时分布在裂解液上清较多（结果未显示），由此确定GST-VIGILIN分段融合蛋白在IPTG终浓度为0.1mmol/L,温度为25℃诱导3h,GST-VIGILIN全长融合蛋白在IPTG终浓度为0.1mmol/L,温度为16℃诱导12h为较理想的蛋白质诱导表达条件。在此条件下进行GST-VIGILIN融合蛋白表达。

　　2.4 VIGILIN全长cDNA及其分段片段的GST融合蛋白诱导表达

　　SDS-PAGE电泳结果见图4A,可见GST-VIGILIN各段融合的蛋白均有表达，GST-VIGILIN全长相对分子质量约为170×103,GST-VIGILIN N端相对分子质量约为40×103,GST-VIGILIN KH1-7相对分子质量约70×103,GST-VIGILIN KH8-12相对分子质量约为60×103,KH13-14相对分子质量约为40×103,C端相对分子质量约为30×103.所有片段大小与估计值大致相符。

　　Western blot结果见图4B,GST-VIGILINKH1-7在略小于70×103处有条带，GST-VIGILINKH8-12在略小于主带的地方同样有一条带。

　　3讨论

　　研究显示VIGILIN蛋白参与了不同基因、mRNA、tRNA、蛋白多层次的调控。目前已发现的有VIGILIN与脂蛋白脂肪酶（LPL）复合体结合参与脂蛋白脂肪酶在血管内皮细胞的转运，调控血浆甘油三酯的代谢[13];VIGILIN与信号肽肽酶signalpeptide peptidase（SPP）形成复合体参与膜蛋白的翻译和错误折叠的消除[14];VIGILIN与mRNA结合维持mRNA的稳定性，与tRNA及翻译延长因子结合保证翻译的效率[15];VIGILIN与组蛋白甲基转移酶SUV39H1结合，维持异染色质的稳定性[16];我室前期研究发现VIGILIN与转录因子CTCF相互作用参与CTCF依赖的IGF2/H19印记基因的调控[7];CTCF介导VIGILIN在卫星序列2结合的减少从而引起HP1a的结合减少等[17].但VIGILIN与这些蛋白质、RNA以及基因相互作用的机制尚不完全清楚。

　　为了进一步研究VIGILIN蛋白与其他因子相互作用的机制，本研究根据VIGILIN蛋白不同的结构域首次成功分段克隆了GST-VIGILIN融合蛋白原核表达载体，并且利用原核表达系统首次成功诱导出GST-VIGILIN融合蛋白。值得注意的是，在Western blot结果中融合蛋白GST-VIGILINKH1-7及GST-VIGILIN KH8-12分别在略小于主带的地方有一条带，说明融合蛋白GST-VIGILINKH1-7及GST-VIGILIN KH8-12在原核表达系统中可翻译出两种分子大小不同的蛋白质，据报道VIGILIN基因可以翻译出相对分子质量约140×103、110×103、90×103、70×103等多种大小不等的蛋白质，在真核细胞中行使不同的功能。但在单纯的SDS-PAGE电泳中并未观察到以上现象，这可能与Western blot在检测蛋白质表达方面灵敏度远远高于单纯的SDS-PAGE电泳有关。这两种融合蛋白的两种不同蛋白质的区别有待进一步确认。

　　本研究采用的原核表达系统大大增加了蛋白表达量，但由于真核生物基因组的复杂性，原核表达系统相比之下缺乏转录后的剪接和加工系统；缺乏翻译后的加工修饰如糖基化、磷酸化、甲基化从而影响蛋白质的功能；在原核系统中表达的真核蛋白缺乏稳定性，容易被细菌蛋白酶污染、常常形成包涵体等。此外，原核表达系统中并无与该蛋白相互作用的其他因子，原核表达系统并不能完全模拟真核表达系统，所以在原核表达系统中通常只能模拟真核细胞蛋白质的直接简单的相互作用。但由于真核细胞中蛋白表达产量低，真核表达系统价格昂贵，目前原核表达系统运用仍然较广泛。

　　综上，本研究成功构建了VIGILIN分段原核表达载体，成功诱导出GST-VIGILIN融合蛋白并进行了鉴定，为进一步研究VIGILIN蛋白的功能打下基础。同时本研究也存在不足之处：由于没有针对VIGILIN分段蛋白的特异性抗体所以无法用VIGILIN抗体检测VIGILIN分段蛋白。