云纹石斑鱼染色体制备实验,渔业论文

　　云纹石斑鱼是一种暖水性中下层鱼类，主要分布于中国的东海和南海，因其具有肉味鲜美等优点，是上等的食用鱼类[1]目前已经成为福建、广东、山东等沿海地区的重要养殖品种，具有很高的经济价值。

　　染色体作为遗传信息的载体，在数目以及形态上具有物种独有的特征。也在一定程度上反应了该物种的进化历史。物种在进化过程中所发生的遗传物质的变化，常以染色体数目以及类型的变化为特征。鱼类的染色体研究是细胞遗传学的一项主要研究内容，在分类学方面对于弄清鱼类的亲缘关系，分化过程等具有重要的意义[2].

　　在细胞遗传学研究中，染色体的制备是一项基本技术。可用于研究鱼类的遗传变异、性别决定、杂交育种以及检测环境污染等多个方面。近些年来，鱼类染色体制备方面的研究取得了较快的发展，目前已有多种方法可以制备染色体。沙珍霞[3]等以花鲈为材料，比较了外周血培养法、细胞培养法、头肾-PHA注射法、头肾-PHA注射-淋巴分离液富集法、小鱼游泳法、组织浸泡法等六种制备染色体的方法，力求找出染色体形态清晰、数目完整、无杂质干扰的染色体制备方法。其中细胞培养法以及淋巴液分离富集法达到了上述要求。

　　目前在我国，已有关于云纹石斑鱼生物学特性[4]、胚胎发育[5]、人工繁殖及规模化饲养[6]等方面的报道，但关于细胞遗传学以及染色体研究方面目前尚未有报道。本研究首次利用细胞培养法进行了云纹石斑鱼染色体制备，以期为这一珍贵的鱼种在后续的遗传育种、性别控制研究、荧光原位杂交以及染色体核型研究等工作提供基础资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂与材料

　　（1）0.075mol/L KCl低渗液：称取1.677g氯化钾粉末溶于300ml灭菌水中溶解。

　　（2）卡诺氏固定液：V甲醇：V冰乙酸=3:1 （甲醇与冰乙酸按3:1体积比混合）

（3）胰蛋白酶消化液：使用前在37℃恒温水浴中预热。

　　（4）6-50代云纹石斑鱼脑细胞系，由黄海水产研究所细胞室建立，在20℃条件下培养至对数生长期。

　　1.2 实验方法

　　（1）秋水仙素处理：在细胞传代结束后48小时，向细胞培养瓶中加入秋水仙素溶液，使得秋水仙素终浓度为10μg/ml,轻轻摇匀。将细胞培养瓶放入24℃恒温培养箱中培养6小时。

　　（2）收集细胞：将100μL预热至37℃的胰蛋白酶消化液加入培养瓶中，将收集管放入离心机，按1200r/min设定转速，离心5min,弃掉上层清液，收集得到的细胞沉淀。

　　（3）低渗悬浮：加入7ml KCL溶液，轻轻吹打，将收集管放入37℃恒温水浴锅内，低渗悬浮细胞30-35min.

　　（5）固定：低渗结束后，缓慢加入1-2ml卡诺氏固定液，轻轻摇匀。1200r/min离心5min,弃上清，收集细胞，再次加入6ml卡诺氏固定液，悬浮固定细胞，冰浴30min.1500r/min离心5min,弃上清，加入2ml以内的卡诺氏固定液，冰浴30min.

　　（6）滴片：采用冷滴片法滴片，将在-20℃冰乙醇中保存的载玻片取出甩干，置于冰盒之上。使用移液器进行滴片，保持滴片高度≥50cm,每片载玻片上滴落2-3滴细胞固定液，在室温环境下自然晾干即可。

　　（7）染色：配好的10%吉姆萨染液（900μL 1×PBS+100μL吉姆萨原液）染色10min,自来水滴小心冲去玻片上的染液，常温下自然晾干。

　　（8）观察：用Nikon 80i显微镜进行观察，先用低倍镜查找分裂像，之后用油镜观察并拍照。

　　2 结果

　　使用本方法，我们获得了较好的云纹石斑鱼细胞中期分裂相，各条染色体分散较开，形态良好。为以后的染色体计数、核型分析以及后续的荧光原位杂交工作提供了基础。

　　染色体计数及核型分析：Giemsa染色之后，我们在显微镜下选取100个中期分裂相来确定染色体数目，并选取10个数目完整，分散良好图像清晰的分裂相进行拍照（图1）。中期分裂相镜检结果表明，在统计的100个分裂相中，染色体数目从30到92不等，染色体数目出现非整倍性。但是48条正常二倍体染色体出现的频率最高，其所占比例为65%,因此可以表明，云纹石斑鱼二倍体染色体众数是48,即2n=48.（图2）

　　3 讨论

　　根据国内对海水鱼类染色体组型的研究结果来看，我国海水鱼类的染色体主要类型为2n=48（占已报道的72%）[7].与已经报道过的石斑鱼类染色体以及本研究在结果上相符。

　　根据以往研究人员在制备染色体过程中所总结的经验来看，无论是采用哪种方法制备鱼类染色体，以下几点都需要注意：

　　（1）选取合适的材料制备染色体：近些年来，染色体制备技术发展较快，外周血培养细胞、肾-PHA短期注射培养细胞、细胞系、活体组织、胚胎等细胞分裂旺盛的器官和组织都可以用来制备染色体。对于一些体型较大的鱼，头肾组织明显，容易取得，可以用来制备染色体。有些鱼体型较小，头肾组织不明显可选用腮等组织或者细胞系法。还有些鱼种比较珍贵，不适合采用剖杀的方法，可剪取部分鳍条进行制备。

　　（2）把握秋水仙素浓度与处理时间：秋水仙素会使细胞分裂停止在有丝分裂的中期，所以可以获得较多的中期分裂相。如果使用的秋水仙素浓度过低或者处理时间过短，则无法获得足够的分裂相；而秋水仙素浓度过高或者处理时间过长，会使得染色体收缩呈短棒状或者粒状，影响结果的分析。

　　（3）控制低渗处理时间：低渗处理的目的是使细胞膨大，便于在滴片时细胞破裂，方便观察到染色体。低渗时间通常在30-35min为宜，超过40min容易造成细胞过早破裂，造成染色体丢失。

　　（4）卡诺氏固定液要现用现配，配完的卡诺氏固定液要放于冰上使用。原因可能是因为醇和酸的混合物在室温下会生成酯，从而影响固定效果。相比于哺乳动物而言，鱼类细胞染色体具有数目多、形态小、分裂指数低等缺点[8],因此想要制备出染色体图像清晰，而且具有大量分裂相的图片是比较困难的。而像荧光原位杂交以及染色体显带分析的技术对染色体制备的要求非常高。利用细胞培养法制备出的染色体，因为其细胞类型单一，所以排除了红细胞的干扰，几乎没有其他杂质，分裂指数高，染色体形态清晰可辨，重复性好。有些研究人员认为细胞培养法制备染色体不易操作，过程复杂[9].但是现在随着细胞培养设施及方法的不断进步，细胞培养的技术已经比较成熟，培养细胞已经成为比较普及的一项技术，本实验室已经建立了多种鱼类的细胞系，相比于其他方法，利用培养好的细胞进行染色体制备并不复杂。

　　总之，利用细胞培养法制备鱼类染色体是一种很有前景的技术，随着更多鱼类细胞系的建立，将来必然会应用于更多种类的鱼类染色体制备。（图略）

　　参考文献

　　[1]朱元鼎。东海鱼类志[M].北京：科学出版社，1962.642.

　　[2]郭丰，王军，苏永全，等。云纹石斑鱼染色体核型研究[J].海洋科学，2006,8:000.

　　[3]沙珍霞，陈松林，叶寒青，等。适合花鲈的几种染色体制备方法的比较[J].中国水产科学，2004,10（6）：469-473.

　　[4]宋振鑫，陈超，翟介明，等。云纹石斑鱼生物学特性及人工繁育技术研究进展[J].渔业信息与战略，2012,27（1）：47-53.

　　[5]宋振鑫，陈超，翟介明，等。云纹石斑鱼胚胎发育及仔，稚，幼鱼形态观察[J].渔业科学进展，2012,33（3）：26-34.

　　[6]黄进光，谢恩义。云纹石斑鱼工厂化健康育苗技术初探[J].水产养殖，2010（4）：8-9.

　　[7]赵金良。我国海水鱼和咸淡水鱼染色体组型研究概述[J].上海水产大学学报，2000,9（4）：344-347.