卡维地洛预先干预对脓毒症大鼠心脏的影响

　　脓毒症（ sepsis） 是感染与感染引起的全身炎症反应[1],进一步发展可导致感染性休克和多器官功能障碍综合征，是当前危重病患者死亡的主要原因之一。心脏是脓毒症易损的靶器官之一。现已知炎性反应和交感神经兴奋、氧化应激等参与了脓毒症的病理生理过程。心血管疾病的常用药物卡维地洛作为第 3 代的 β 受体阻滞剂，兼有 α 受体阻滞剂、抗氧化、抗心律失常、抑制中性粒细胞浸润等特性，经过临床观察，长期服用过卡维地洛的患者在发生脓毒症时，治疗效果多较其他未曾服用过此药物的患者好，目前关于卡维地洛对脓毒症心脏的影响研究也不多见，该研究旨在明确卡维地洛预先干预对早期脓毒症大鼠心脏的影响。

　　1 材料与方法

　　1. 1 试剂与仪器 卡维地洛粉剂（ 美国 Sigma 公司） ; 脂多糖（ lipopolysaccharide,LPS） （ 上海纪宁实业有限公司） ; 丙二醛（ malondialdehyde,MDA） 、超氧化物歧化酶（ superoxide dismutase,SOD） 测试盒（ 南京建成生物工程研究所） ; solar3000 多功能心电监护仪（ 美国 GE 公司） ; 罗氏 2010 电化学发光仪（ 北京英博科贸有限公司） ; LG10-2. 4A 离心机（ 北京医用离心机厂） ; 低温高速离心机（ D-37520,德国 Sig-ma 公司） ; 紫外分光光度计（ 美国 HP 公司） ; 电动玻璃匀浆机（ 宁波新芝公司） ; 液相色谱仪（ 郑州国达仪器设备有限公司） ; Olympus 光学显微镜（ BX51,日本奥林巴斯公司） ; 7170 全自动生化分析仪、JEM-1230 透射电镜（ 日本日立分司） .

　　1. 2 动物分组及处理 40 只雄性 Wistar 大鼠（ 南昌大学医学院实验动物科学部提供） ,体重 250 ~300 g,随机分为脓毒症组（ S 组） 、脓毒症卡维地洛预先干预组（ CS 组） 、生理盐水对照组（ N 组） 和卡维地洛对照组（ C 组） ,每组 10 只。① CS 组大鼠给予卡维地洛 10 mg/（ kg·d） 灌胃，1 次/d; 4 周后尾静脉注射 LPS（ 20 mg/kg） 制备脓毒症模型； ② S 组大鼠给予卡维地洛等容量的生理盐水灌胃，4 周后尾静脉注射 LPS（ 20 mg/kg） 制备脓毒症模型； ③ N组大鼠给予与卡维地洛等容量的生理盐水灌胃，尾静脉注射与 LPS 等容量的生理盐水； ④ C 组大鼠给予卡维地洛 10 mg/（ kg·d） 灌胃，1 次/d; 4 周后尾静脉注射与 LPS 等容量的生理盐水。

　　1. 3 动脉血压、心率测定 以注射 LPS 为时间起点，24 h 后各组实验大鼠于 10% 水合氯醛 300 mg/kg 腹腔注射麻醉后，行右股动脉插管、连接多功能心电监护仪测定动脉血压、心率。

　　1. 4 心肌酶谱、血清 N 末端脑钠肽前体（ amino-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proB-NP） 检测 测完血压心率后，心脏穿刺取血 4 ml,2ml 用于全自动生化检测仪检测心肌酶谱磷酸肌酸激酶（ creatine kinase,CK） 和磷酸肌酸激酶同工酶MB（ creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB） ; 2 ml 用于电化学发光法测定大鼠血清 NT-proBNP.

　　1. 5 心肌组织处理及心肌 SOD、MDA 和 ATP 检测 取血后立即开胸，迅速取出大鼠全心室，心尖处三分之一液氮冻存以备心肌三磷酸腺苷（ andade-nosine triphosphate,ATP） 测定，中间三分之一福尔马林固定以备病理检查，心底三分之一组织匀浆后按试剂盒方法测定 SOD 和 MDA 含量。以反相高效液相色谱法测定 ATP 含量。

　　1. 6 病理检查 光镜标本经 10% 中性福尔马林固定，常规石蜡切片，HE 染色后光镜观察，电镜标本经 3%戊二醛溶液固定，1% 锇酸后固定，乙醇 - 丙酮溶液逐级脱水，EPON812 包埋，AO 恒低温切片机切片，醋酸铀和枸橼酸双染色，电镜观察。4 组标本处理、电镜观察条件等均相同。

　　1. 7 统计学处理 采用 SPSS 11. 5 软件进行分析。计量资料以珋x ± s 表示。多组间比较采用方差分析。

　　2 结果

　　2. 1 各组大鼠心率、血压、心功能比较 与 N 组比

　　较，S 组大鼠心率明显增快，而 C 组和 CS 组大鼠心率明显减慢，S 组和 CS 组大鼠血浆 CK、CK-MB 和NT-proBNP 浓度均明显增高（ P < 0. 05） .与 S 组比较，C 组和 CS 组大鼠血浆 CK、CK-MB 和 NT-proBNP浓度均明显下降（ P <0. 05） .与 C 组比较，CS 组血浆 CK、CK-MB 和 NT-proBNP 浓度均明显增高（ P <0. 05） ,而心率差异不大。4 组中 S 组血压最低，其次为 CS 组，再次为 C 组，但各组间血压差异无统计学意义（ P >0. 05） .见表 1.

　　2. 2 各组大鼠心肌 MDA、SOD 和 ATP 浓度比较

　　与 N 组比较，S 组心肌 MDA 浓度明显增加，SOD、ATP 浓度明显降低（ P < 0. 05） ; CS 组心肌 ATP 明显下降（ P < 0. 05） ,但 MDA 和 SOD 浓度与 N 组差异无统计意义（ P >0. 05） ; C 组心肌 MDA 浓度明显下降，SOD 浓度明显上升（ P <0. 05） ,而 ATP 浓度与 N组差异无统计意义（ P >0. 05） .与 S 组比较，CS 组和 C 组心肌 MDA 明显下降，SOD、ATP 浓度上升（ P< 0. 05） .与 C 组比较，CS 组心肌 ATP 浓度明显下降（ P < 0. 05） ,而心肌 MDA 和 SOD 浓度差异两组差异无统计学意义（ P >0. 05） .见表 2.

　　2. 3 各组大鼠心肌病理改变 光镜下心肌病理改变： N 组和 C 组心肌细胞排列均匀整齐，横纹清楚，细胞大小均一，心肌细胞间隙无变化。S 组心肌细胞略肥大，心肌细胞排列稍紊乱，CS 组心肌变化介于两者之间。4 组间差异并不显著。
电镜下心肌线粒体改变： C 组与 N 组心肌细胞内线粒体结构完整，形态正常，S 组心肌细胞内线粒体密度降低，体积增大，嵴数量减少，嵴膜清晰度下降，基质电子密度减低，部分粗面内质网增生，增生的粗面内质网常密集成片，形成指纹状结构或围绕变性的线粒体； CS 组心肌细胞线粒体也表现为密度降低，体积增大，峭数量减少，基质电子密度降低，但程度较 S 组减轻。

　　3 讨论

　　脓毒症患者中大约 40% ~ 50% 会合并心脏功能不全 （ sepsis-induced myocardial dysfunction,SIMD） ,其中出现严重心功能衰竭 （ 心衰 ） 者约7%[2].近 30 年来关于 SIMD 的研究没有取得实际性进展，近年来有心肌保护作用的 β 受体阻滞剂在脓毒症中的应用逐渐受到重视[3].研究[4]显示 β受体阻滞剂可产生抗炎和心肌保护作用，如果预先给予 β 受体阻滞剂可降低脓毒症大鼠的死亡率。

　　β 受体阻滞剂可减慢心率、降低心肌耗氧、改善心肌供血。而快速心律失常作为脓毒症的临床特征，一直被认为是对心脏充盈不良、肾上腺素能神经刺激、发热现象的反映。心率也常作为预测感染性休克患者存活率的重要因素[5].本研究显示预先给予 β 受体阻滞剂卡维地洛可明显减慢大鼠在脓毒症时的心率，而对血压无明显不良影响。

　　研究[6]显示，脓毒症时心肌受抑制情况常常存在，甚至进展到心功能不全。血清 CK 和 CK-MB 检测对心肌损伤的初步筛查具有一定的特异性。其中CK-MB 主要存在于心肌细胞，当心肌细胞受损时，CK-MB 从心肌细胞内释放，其升高程度与心肌损害程度呈正相关性。NT-proBNP 是由心室释放的心脑神经激素，可以更加敏感地反映心功能[7],本实验中大鼠在发生脓毒症 24 h 时 CK、CK-MB、NT-proB-NP 值均明显升高，这个结果与临床上观察到的心肌受损后 CK 及 CK-MB 在6 ~24 h 内急剧升高现象相符。卡维地洛对正常大鼠 CK、CK-MB、NT-proBNP并无影响，但预先给予卡维地洛干预可降低脓毒症大鼠 CK、CK-MB、NT-proBNP 值，不过这些心功能指标仍明显高于正常水平，说明卡维地洛对早期脓毒症大鼠心脏功能有一定的改善作用。

　　氧化应激是导致衰老和疾病的一个重要因素。脓毒症时，由于氧化应激，自由基大量产生，抗氧化剂则相对减少或产生不足，细胞氧化损伤不可避免[8].SOD 是一种重要的抗氧化金属酶，其活性可反映机体氧化应激水平、防御自由基损伤、保护生物膜免受自由基攻击伤害的能力[9 -10].MDA 是脂质过氧化的重要指标，是具有损害作用的氧化应激产物。脓毒症大鼠心肌 SOD 含量明显下降，MDA 含量明显增加，提示脓毒症时，脂质过氧化反应增强，氧自由基生成大量增加，超过机体的清除能力，而卡维地洛能降低正常大鼠及脓毒症大鼠心肌 MDA 含量，升高 SOD 含量，说明卡维地洛可减弱心肌脂质过氧化，增强心肌抗氧化能力。

　　机体各种生理活动最直接的供能物质-ATP 合成于细胞线粒体内膜，而线粒体是对各种损伤最为敏感的细胞器之一，脓毒症时，心肌线粒体合成的能量不能满足心脏需要，或线粒体受损后能量合成不足，则会出现心脏功能障碍，甚至衰竭[11]
.本研究证实在早期脓毒症心脏组织中的 ATP 含量就明显降低，卡维地洛并不影响正常心肌 ATP 含量，但预先给予卡维地洛可减轻脓毒症心肌 ATP 含量的下降。

　　理论上心功能受损时心肌细胞形态也会有改变。脓毒症时心肌 ATP 降低也应与线粒体功能受损密不可分。但本实验结果显示： 脓毒症心肌在光镜下无明显变化，电镜下心肌线粒体虽有一定程度的肿胀、基质密度不均匀的降低，但变化并不显著，卡维地洛预先干预对早期脓毒症心肌形态的影响也不明显。可能观察的时机是脓毒症早期，心肌受损的程度还不至于引起心肌细胞形态结构明显改变。

　　综上所述，脓毒症早期表现为心率增快、心功能受损、心肌氧化应激、线粒体合成 ATP 减少可能是SIMD 发生的一个病理生理机制； 卡维地洛可减慢正常大鼠心率，提高抗氧化应激能力，预先给予卡维地洛可减轻脓毒症时大鼠心肌 ATP 合成障碍，改善心功能，其机制可能与其抗氧化应激有关。但卡维地洛并不能完全纠正脓毒症时大鼠的心脏异常改变，由此推测除氧化应激外还有其它机制参与了 SIMD的发生。