红细胞生成素在慢性肾病患者贫血治疗中的作用

　　红细胞生成素（erythropoietin,EPO）是由胎肝和成人肾产生的 3.04×104的糖蛋白激素，受严格的低氧诱导方式调控分泌，发挥刺激造血和调节组织氧平衡的作用。EPO 受体在非造血组织的存在揭示了其是一种多效性细胞因子。在慢性肾病（chronickidney disease,CKD） 患者的贫血治疗过程中发现，重组人红细胞生成素 （recombinant human EPO,rhEPO）可以改善贫血带来的不利影响，包括氧利用率减少、心输出量增加、左心室肥厚（left ventricularhypertrophy,LVH）、认知能力和性欲下降、免疫应答减弱等。此外，EPO 可以通过减少缺血和氧化应激或增强抗凋亡过程，预防肾间质纤维化和肾小管上皮细胞的破坏。同时，它能直接通过对血管内皮细胞完整性的维持和促进血管修复等作用，延缓 CKD进展，降低 CKD 患者心血管疾病（cardiovasculardisease,CVD）发生率。

　　1 打破"心-肾-贫血综合征"的恶性循环

　　"心-肾-贫血综合征"这一概念首先由 Silver-berg 提出，可将其理解为：终末期 CKD 患者当肾小球滤过率（glomerular filtration rate,GFR）<25 ml/min时，常合并充血性心力衰竭（congestive heart failure,CHF），两者可共同引起贫血；贫血可通过加快心率和增加搏出量引起心脏负荷增加，长期贫血引起左心室代偿性肥厚扩张，加重 CHF;CHF 可导致肾灌注不足加速 CKD 进展，GFR 下降引起的体液潴留进一步加重心脏负荷。CHF、贫血和 CKD 三者互为因果，其中任何一方均可引起或加重其他两者，形成恶性循环。GFR 越低，贫血越严重，心衰分级越高。贫血是"心-肾-贫血综合征"得以维持的最关键一环。EPO 能显著提高 CKD 患者的认知能力、运动耐力和生活质量，同时可减少输血次数及输血相关并发症。更重要的是，EPO 在改善贫血状态的同时打破了"心-肾-贫血综合征"这一恶性循环，降低了患者住院风险和病死率，改善了远期预后。一方面，EPO 通过纠正贫血，直接改善心肌氧供，降低心输出量和心脏负荷；另一方面，EPO 可对抗炎症因子和氧化压力对心肌细胞的损伤，提高心肌细胞存活率。此外，EPO 还可通过促进心肌血管再生和诱导内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide syn-thase,eNOS）合成，增加心肌血供[1].

　　在动物研究中，应用 EPO 可阻止心肌缺血模型大鼠心肌肥大、纤维化和坏死的进展。这些心肌保护作用主要源于 EPO 的抗炎、抗凋亡和血管源性保护特性。心力衰竭时心肌细胞 EPO 受体表达上调，应用 EPO 治疗后，大鼠衰竭心脏中的炎症因子如IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α 和转化生长因子（transforming growth factor,TGF）-β 的高水平表达可降低到接近正常，幸存心肌的氧化损伤也大大减弱。在心肌梗死模型大鼠的梗死心肌边界区单次大剂量注入 3000 U/kg EPO,24 h 后梗死区周围心肌活性细胞周期蛋白 D1 和细胞分裂周期样激酶 2 基因表达显著增强，48 h 后梗死区周围 Ki-67 阳性的心肌细胞表达增强 45%,7 d梗死区周围心肌毛细血管密度提高 17%,6 周后左心室对多巴酚丁胺的敏感性显著增强，且在心脏和远处器官均未见血栓形成，无明显全身副作用发生[2].

　　在 CKD 患者中，与高血压和糖尿病发生率相比，贫血是 LVH 的最强危险因素。在 GFR<25 ml/min 的 CKD 患者中，>80%合并贫血，低血红蛋白（hemoglobin,Hb） 水平与 LVH 发生率增加密切相关，平均 Hb 每下降 0.62 mmol/L,将直接表现为肌小节长度的增加和肌丝重叠的加重，进而左室肌厚度增加以抗衡其半径增加。在对贫血改善不达标的维持性血液透析患者超声心动图结果的分析中发现，常有心肌代偿性肥厚的左室扩张改变，EPO 能逆转高输出状态所致的不良血流动力学变化。

　　Mukhopadhyay 等[3]研究发现，接受 rhEPO 治疗的血液透析患者，在贫血纠正的同时，左室体积指数、室间隔厚度、左室舒张末直径均有明显下降，LVH 发生率明显降低，提示伴有贫血的终末期 CKD 患者，在应用 rhEPO 治疗改善贫血状态的同时，能够获得明显的心脏保护作用。此外，对伴有明确缺血性心脏病或 CHF 的透析人群使用 rhEPO 治疗使红细胞压积升高的同时，显著降低了其运动诱发的心肌缺血，患者的病死率显著下降。Palazzuoli 等[4]

　　在一项旨在评估 CHF 患者中贫血的流行情况、严重程度，以及纠正贫血对心肾功能、住院率影响的研究中发现，给予心功能Ⅳ级的患者（7.2±5.5）个月 EPO 皮下注射联合静脉铁剂治疗，Hb 和心功能分级显著改善的同时，利尿剂的用量和住院风险大幅降低，GFR下降速度放缓，患者的运动耐力增加，生活质量改善，且未发现明显的血栓或高血压事件，但终末期CKD 患者若已发展至严重 LVH 或左室扩张，EPO替代治疗带来的心脏保护作用可能有限。

　　2 延缓肾间质纤维化的进展

　　肾小管间质纤维化（tubulo interstitial fibrosis,TIF）是各种肾病终末期的共同病理过程。TIF 的主要病理改变为肾小管萎缩、肌成纤维细胞活化、细胞外基质过度堆积和炎性细胞浸润，最终取代正常肾组织结构，造成肾功能不可逆受损。TIF 的程度是决定 CKD 预后的重要因素，因此阻断 TIF 过程对CKD 的治疗具有重要意义，EPO 可通过多种机制抑制TIF的发展，延缓CKD向终末期肾病发展的进程[5].

　　近年来，肾小管上皮细胞在 TGF-β、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）-2 等的诱导下向间充质细胞转化（epithelial-mesenchymaltransition,EMT）被认为是 TIF 启动和进展的核心机制。Park 等[6]分别通过体内外实验探讨了 EPO 对EMT 过程的影响，研究团队通过在体外培养的狗肾细胞中加入刺激因素 TGF-β，诱导 EMT 的发生，EPO可以通过抑制细胞分泌 α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA） 和弹性蛋白延缓 TIF.

　　动物实验在单侧输尿管梗阻致肾间质纤维化模型中同样观察到，接受 EPO 治疗后受损肾组织中TGF-β 的表达明显减少，α-SMA 下调，TIF 程度减轻。Wang 等[7]研究发现，给予链脲佐菌素（streptozo-tocin,STZ）诱导的糖尿病肾病大鼠 EPO 治疗，可以显著抑制肾组织中 TGF-β 的表达，降低骨桥蛋白和黏附分子的分泌，减少尿蛋白排泄和胶原沉积，减轻肾小球硬化和 TIF 程度，保护肾功能。Bahlmann等[8]利用 5/6 肾切除手术建立大鼠肾间质纤维化模型，造模后 1 周开始给予治疗组达贝泊汀（darbe-poetin）0.1 μg/kg 每周 1 次，连续观察 6 周，发现使用 EPO 治疗的大鼠肾间质纤维化及内皮损伤程度、生存率和肾功能都较对照组有明显改善，EPO 的长效肾保护机制可能与持续激活 AKT 信号转导通路有关。

　　3 维持肾局部毛细血管网结构及功能的完整性

　　肾小球自身特殊的毛细血管网结构及丰富的血管网分布对于其功能的维持发挥着重要作用。

　　CKD 患者体内由于氧化应激、微炎症等因素持续存在，使得肾小球毛细血管内皮细胞结构损伤和功能缺失，毛细血管网结构和功能的完整性得不到有效维持，从而加速了肾小球硬化和肾间质纤维化的进展。因此维护肾局部毛细血管网结构和功能的完整性对 CKD 患者肾组织修复和肾功能改善具有重要意义。

　　EPO 一方面可通过抑制内皮细胞凋亡维持血管内皮的结构完整性，并通过活化端粒末端转移酶，维持端粒的长度间接延缓毛细血管内皮细胞的衰老和死亡[9];另一方面能促进血管内皮细胞生长因子的表达，诱导内皮祖细胞（endothelial progenitorcells,EPC）从骨髓向外迁移，通过促进血管内皮细胞有丝分裂和上调基质金属蛋白酶-2 表达刺激其增殖分裂及黏附分化为血管内皮细胞形成血管，同时促进新生的毛细血管向无血管区伸展，维持和重建肾局部血液供应，促进肾组织修复[10-11];EPO 还可以通过上调内皮细胞 eNOS mRNA 的表达，介导AKT 依赖的 eNOS 磷酸化，进一步增加 eNOS 活性，维持正常血管内皮的自身调节功能，在 CKD 进展期预防低氧造成的肾间质损伤进一步扩散。此外，EPO 还可在肾小球足细胞损伤时维持细胞间的紧密连接结构，防止滤过屏障通透性增加，减轻肾小球损伤[12].De Luisi 等[13]研究发现，EPO 可显著增加维持毛细血管形态和促进血管生成的关键介质，如血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和单核细胞趋化蛋白的表达，同时 EPO 还可以促进 EPC 从骨髓动员出来并迁移到损伤区，分化为血管内皮细胞，促进损伤区血管内皮的修复和血管的新生，从而在抑制内皮细胞凋亡，增加肾小球和肾小管间质的毛细血管网密度，改善肾组织缺血低氧状况，保护残余肾单位等方面发挥重要作用。

　　4 保护腹膜功能

　　大量研究证实，长期接触非生理性的低钙腹膜透析液可引起腹膜间皮细胞（peritoneal mesothelialcells,PMC）损伤和腹膜组织形态改变，PMC 的凋亡是导致腹膜剥蚀和慢性纤维化的重要因素，抑制PMC 的凋亡是维护腹膜结构和功能完整，延缓腹膜慢性功能失调的重要途径[14].Choi 等[15]在一项前瞻性随机对照研究中比较了新型生物相容腹膜透析液与传统腹膜透析液对腹膜功能的影响，研究发现，新型腹膜透析液中性 pH 值和低浓度葡萄糖降解产物的特性，使其在维持腹膜超滤功能和提高PMC 标志分子 CA125 的表达水平等方面有显著优势，但在对两组患者进行腹膜活检时发现，均存在不同程度的 PMC 凋亡及数量减少。Vorobiov 等[16]将体外分离的小鼠 PMC 用 5000U/kg rhEPO 预孵育 1h,再暴露于 4.25%的腹膜透析液中，发现 EPO 可以通过诱导 JAK2、STAT5 和 ERK1/2 的活化，抑制P38 磷酸化，降低胱天蛋白酶（caspase）-3 的表达活性，减轻腹膜透析液诱导的 PMC 凋亡，发挥腹膜保护作用。

　　5 调节炎症-氧化应激水平

　　由于尿毒症毒素蓄积、营养不良、免疫功能低下、透析生物膜不相容性等因素的综合作用，终末期 CKD 患者在没有全身或局部临床感染症状的情况下，体内存在一种以单核-巨噬细胞系统激活为驱动，以炎性细胞因子释放为特征的缓慢发生和持续存在的微炎症反应。此外，通过分析内皮细胞在尿毒症血清和正常血清条件下的蛋白表达差异发现，在尿毒症血清刺激下，与氧化应激有关的蛋白表达明显增加，内皮细胞活性氧释放明显增多，提示终末期 CKD 患者体内存在高水平的氧化应激反应[17].

　　炎症与氧化应激相互促进，形成恶性循环，与 CKD患者 CVD 的发生率密切相关。因此，积极调节炎症-氧化应激水平，对减少 CKD 患者 CVD 具有重要意义。EPO 可通过调控炎症反应的关键转录因子 NF-κB的活性，抑制致炎因子，上调抗炎因子，减轻炎性细胞的浸润，发挥重要的抗炎作用，同时 EPO 通过上调抗氧化酶的表达及下调氧自由基的生成对终末期 CKD 患者的氧化应激水平同样有明显改善[18].

　　Honda 等[19]观察 rhEPO 对体内炎症-氧化应激状态的影响时发现，rhEPO 治疗 3 个月后血中 Hb、红细胞容积明显上升，治疗 6 个月后 Na+-K+-ATP 活性显著升高，高敏 C 反应蛋白、丙二醛、晚期氧化蛋白产物含量显著下降，提示 rhEPO 长期治疗在改善维持性血液透析患者贫血状态的同时，还可有效缓解体内炎症-氧化应激状态。研究还发现，EPO 对炎症反应的调节作用表现为对 IL-2、IL-10、IL-12 等保护性炎症因子的表达上调，而对 TNF-α、IL-6 等损伤性炎症因子的表达下调。Kristal 等[20]研究发现，EPO 同样可以抑制持续不卧床腹膜透析患者体内的炎症反应，表现为直接弱化多形核白细胞启动，减少外周血中性粒细胞计数。Adelibieke 等[21]研究发现，EPO 可通过刺激内皮细胞持续低水平合成、释放 NO,抑制白细胞与内皮细胞的黏附，进而抑制白细胞的激活和氧自由基的释放，降低血管通透性和炎性渗出。

　　6 改善营养不良-炎症-动脉粥样硬化综合征

　　Stenvinkel 等在 1999 年首次提出了营养不良-炎症-动脉粥样硬化综合征（malnutrition inflammationarteriosclerosis syndrome,MIAS）这一概念，认为微炎症可以促进动脉粥样硬化的发生，使业已存在的营养不良更难纠正；营养不良导致肝反应性合成亢进，脂蛋白增加，出现高脂蛋白血症，加重动脉粥样硬化，同时导致自身免疫功能障碍，诱发感染，加重微炎症状态，形成恶性循环，MIAS 以炎症反应为核心环节。动脉粥样硬化的形成过程本质上是以炎症反应为基础，以内皮持续损伤、脂质浸润、黏附分子表达、趋化因子生成、单核巨噬细胞迁移、平滑肌细胞增生、冠状动脉狭窄为病理生理学特征，是终末期 CKD 患者最常见的心血管并发症[22-23].

　　EPO 长期疗法可改善高密度脂蛋白相关血小板活化因子乙酰水解酶与总体血浆酶活性比值低而致动脉粥样硬化的比率，表明 EPO 在抗动脉粥样硬化中发挥重要作用。Tsouchnikas 等[24]对维持性血液透析患者进行了为期半年的随机对照研究，发现EPO 治疗组患者在 Hb、Hct 升高及全身状况改善的同时，血清铁、脂蛋白-α 明显下降，表明 EPO 治疗能有效改善维持性血液透析患者的脂质代谢水平，降低动脉粥样硬化发生率，提高透析患者的生存质量，这与 EPO 改善了 MIAS 的核心环节炎症反应密切相关。

　　7 增强 CKD 患者的免疫功能

　　终末期 CKD 患者普遍存在免疫功能低下，由此引发的感染相关并发症严重威胁患者生存。越来越多的证据表明，EPO 可通过对体液免疫、细胞免疫及红细胞免疫的调节，增强终末期 CKD 患者的自身免疫功能，避免感染的发生和降低感染死亡率。

　　7. 1 增强体液免疫

　　研究显示，EPO 可以在脾细胞增殖反应亢进情况下诱导脂多糖含量升高，使体液中保持较高水平的内源性多克隆免疫球蛋白，进而发挥抗肿瘤作用。Katz 等[25]研究发现，应用 EPO 可以增加小鼠体内针对不同抗原的特异性抗体的产生，提示 EPO 对体液免疫具有增强作用。临床试验发现，EPO 治疗 8周后 CKD 患者血液中的 IgA、IgG 水平显著升高，在体外实验中将 2 IU/m1 EPO 与外周血单个核细胞共孵育，在商陆丝裂原的刺激下，IgG、IgA、IgM 的产生分别增加了 19%、28%和 32%,提示 EPO 可以直接刺激 B 淋巴细胞产生免疫球蛋白，从而提高 CKD患者的体液免疫功能，使感染发生率下降。

　　7. 2 增强细胞免疫

　　EPO 替代疗法可以引起 CD8+T 淋巴细胞依赖性免疫功能的恢复，EPO 治疗后 CD4+/CD8+T 细胞的比值显著升高，Th1 类细胞因子 IL-2、IL-12 等明显增高，细胞因子优势类型向 Th1 类转化，机体免疫力由此增强，这是 EPO 增强 CKD 患者细胞免疫功能的核心机制。Trzonkowski 等[26]研究发现，EPO治疗后表达 CTLA-4 的 CD8+T 细胞降低，而表达CD28 的 CD8+T 细胞升高，CD4/CD8 的比值显著升高，患者感染发生率显著降低，表明 rhEPO 对终末期 CKD 患者 T 淋巴细胞亚群的免疫功能紊乱有调节作用。Pereira 等[27]研究发现，血液透析患者 T 淋巴细胞对丝裂原的反应降低，多形核白细胞的趋化及吞噬功能下降，接受 rhEPO 治疗 6 周后，T 淋巴细胞对植物血凝素、刀豆蛋白 A 及抗 CD3 的增殖反应增加，多形核白细胞的吞噬功能得到一定程度的改善，外周血白细胞及淋巴细胞计数明显增加。

　　研究还发现，体外培养的尿毒症患者中性粒细胞杀念珠菌活性降低，去除尿毒症血清后，其活性可恢复到正常水平，体外加入 rhEPO 可明显增强其活性。

　　7. 3 增强红细胞免疫

　　存在于红细胞膜表面的补体受体具有免疫黏附活性，与 C3b 形成免疫复合物，由肝网状内皮系统清除，使红细胞在清除机体免疫复合物、抗感染等方面发挥重要作用。氧自由基与细胞膜多元不饱和脂肪酸结合，产生多种脂质过氧化物，导致脂质过氧化损伤，改变了细胞膜的液体流动性和通透性，进而造成膜功能障碍，直接影响 C3b 受体的活性，最终导致红细胞免疫功能下降。EPO 不仅可通过提高红细胞数目增加红细胞免疫黏附作用，且可通过改善红细胞膜的理化特性，使 C3b 受体的功能得以正常发挥，维持红细胞的免疫功能。

　　在 CKD 患者使用 rhFPO 治疗前后 C3b 受体花环结合率 （red blood cell C3b receptor rate,RBC-C3bRR） 的变化及其与红细胞超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD） 和血浆过氧化脂质（lipid peroxide,LPO） 浓度的相关性研究中发现，EPO 可明显提高红细胞 SOD,降低血浆 LPO,减轻脂质过氧化损伤。使用 rhEPO 规律治疗 1 月后，治疗组 Hb 水平及血肌酐水平较对照组明显改善，Hb浓度与 RBC-C3bRR 呈正相关，血肌酐水平与 RBC-C3bRR 呈负相关。随着贫血的改善，患者红细胞膜流动性较治疗前显著提高，红细胞膜表面的免疫抑制因子表达下降、免疫促进因子表达升高、C3b 受体活性升高、感染的发生率明显下降。说明了 rhEPO可通过降低氧化压力改善红细胞膜流动性，间接提高 C3b 受体的活性及红细胞的免疫黏附功能[28].也有研究发现，血液透析患者经 rhEPO 治疗后 CD3、细胞因子、淋巴细胞刺激指数有显著变化，并认为rhEPO 并不直接影响患者的免疫功能，而是通过增加红细胞数，使红细胞表面淋巴细胞功能相关抗原-3 与 CD2 受体结合，增加细胞因子的分泌，间接增强了 T 淋巴细胞的免疫功能[29].

　　8 结语

　　虽然国内外不少研究都已证实 EPO 对 CKD 患者具有多重保护作用，但大多研究还停留在实验室水平，且部分动物及细胞实验中的 EPO 给药剂量已远远超过其纠正贫血的治疗剂量，因此要把 EPO 真正全面地应用于 CKD 的预防和治疗还面临诸多问题。目前仍缺乏大规模临床随机对照试验和荟萃分析评价 EPO 多效性治疗的长期临床效果及不良反应，确定起始给药时机、最佳给药方式、安全的目标血红蛋白水平、最大剂量和疗程等重大问题尚无统一标准。相信随着临床和基础研究的不断深入，以及 EPO 新型类似物的不断出现，EPO 终将成为CKD 一体化治疗中的重要一员。