脾虚气弱肠易激综合征便秘的大鼠模型构建研究

　　肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是常见的功能性肠病，临床上以腹痛或腹胀，常伴有排便习惯改变和(或) 粪便性状改变为特征，多缺乏公认的形态学、生化指标或基因异常的改变，常分为腹泻型肠易激综合征、便秘型肠易激综合征和交替型肠易激综合征［1-3］。IBS-C 属于中医“便秘”、“气秘”、“脾虚”等范畴，病机关键在于脾虚气滞，但与肝的关系密切。肝郁是本病的一个诱因，脾虚气弱是本病的一个基本病理过程，肝郁脾虚气滞是 IBS-C 发病的一个重要病理机制。肝与情绪恼怒变化关系最为密切，因肝为将军之官，不受遏郁，主疏泄气机，易为情志所伤，而肝木有病则气机拂郁，脾运化受制。因此，IBS-C 是因肝郁日久伤脾，加之素体脾气虚弱，中气不足，推动无力，气虚而滞导致大肠传导功能失常［4-6］。

　　前期研究已完成了 IBS-D 动物模型的建立及评价，发现早期母婴分离能造成脑-肠轴功能的紊乱［7，8］，为本研究提供了借鉴。目前，便秘动物模型的建立多采用冰水灌胃法、黄连素或复方地芬诺酯诱导法、禁水不禁食法等［9，10］，前期研究表明，这些方法所建立的模型具有便秘的特征，其重复性和稳定性均较好，但无法复制 IBS-C 反复发作的临床特征，且停止刺激后动物可自愈，不适合应用于药效验证。本研究拟采用早期母婴分离诱导脑-肠轴功能紊乱，分别结合冰水灌胃法、限水法制作 IBS-C 大鼠模型，并建立其评价体系，筛选出最佳的 IBS-C 模型。

　　1 材料与方法

　　1. 1 实验动物

　　剔除雌性的初生 SD 乳鼠 20 窝(133 只) ，SPF级，购自广州中医药大学实验动物中心【SCXK(粤)2013-0020】，与母鼠同笼，第 21 天后断奶并与母鼠分笼，实验操作在广州中医药大学第一附属医院SPF 级实验设施中进行【SYXK(粤) 2013-0092】，常规摄食饮水，光照为保持昼夜节律各 12h。温度控制在 18 ～24℃，相对湿度控制在 50% ～ 70%，实验时室温维持在 24 ～26℃。

　　1. 2 主要仪器与试剂

　　电子分析天平(日本岛津) ; 烘箱(苏州台华烘箱设备有限公司) ; 大鼠粪尿分离代谢笼(北京佳源兴业科技有限公司) ; Olympus-BX60 光学显微镜，O-lympus-DP10 数码相机，均购于日本奥林巴斯公司;直肠扩张实验仪为本实验室自制。

　　1. 3 动物分组

　　取 SD 大鼠 20 窝，按窝随机分为 6 组。A 组 3窝 18 只，B 组 3 窝 23 只，C 组 3 窝 19 只，D 组 4 窝26 只，E 组 3 窝 19 只，F 组 4 窝 28 只。其中 A 组作为正常组，B 组为母婴分离组，C 组为冰水灌胃组，D组为母婴分离结合冰水灌胃组，E 组为限水组，F 组为母婴分离结合限水组。

　　1. 4 造模方法

　　各组大鼠均从出生后适应性饲养 1 周，第 21 天断奶，雌雄分笼。分别按照以下方法造模:母婴分离法［11］: 每天将乳鼠与母鼠分离，单笼饲养 180 min 后再与母鼠同笼饲养，共 14 天。冰水灌胃法［9］: 给予大鼠0 ～4℃生理盐水2 mL灌胃，每日 1 次，共 14 d。限水法: 采用普通饮水瓶手持辅助饮水，每天分两次给水，第一次给 1/3，第二次给 2/3，间隔 12 h。

　　于开始限水第 1、2 天分别给予未限水前 5d 平均水量的 1/6，第 3 ～ 6 天给 1/5，第 7 ～ 10 天给 1/4，第10 ～ 14 天给 1 /3，取整数值。

　　A 组正常饲养，不做任何处理; B 组从第 8 ～ 21天进行母婴分离操作，之后正常饲养; C 组第 8 ～21天正常饲养，第 22 ～ 35 天冰水灌胃; D 组第 8 ～ 21天进行母婴分离，第22 ～35 天冰水灌胃; E 组第8 ～21 天正常饲养，第 22 ～ 35 天限水; F 组第 8 ～ 21 天进行母婴分离，第 22 ～35 天限水。
　　
　　2 结果

　　2. 1 模型的评价

　　2. 1. 1 大鼠一般行为及生理指标评价

　　造模结束后(第 36 天) 观察并记录各组大鼠的毛色、大便、进食和饮水、精神状态等。结果 A 组活动快速，毛发浓密有光泽，进食和饮水正常，大便未见异常; B 组大鼠活动正常，毛发有光泽，进食和饮水正常，形体略有消瘦，可见便溏或便秘; C、D、E、F组大鼠出现毛色无光泽且竖起、拱背、活动减少、易躁易怒、进食量减少、形体消瘦、大便数量减少且颗粒变小质地坚硬。分别随机抽取各组大鼠 10 只，测定各组大鼠体重及 24h 进食量，结果见表 1。

　　体重测定结果发现，母婴分离组和正常组大鼠体重差异无显着性(P ＞0. 05) ，而以冰水灌胃法、限水法及母婴分离结合冰水灌胃法、限水法的大鼠的体重较母婴分离组和正常组比较均显着降低(P ＜0. 05) ; 与母婴分离组和冰水灌胃组比较，母婴分离结合冰水灌胃法体重显着下降 (P ＜ 0. 05，P ＜0. 05) ; 与母婴分离组比较，限水组和母婴分离结合限水组的体重均显着下降(P ＜ 0. 05) ，但限水组和母婴分离结合限水组的体重差异无显着性。

　　进食量的研究结果表明，与正常组大鼠比较，其他各组大鼠的 24 h 进食量均显着降低(P ＜0. 05) ;与母婴分离组比较，冰水灌胃组、母婴分离结合冰水灌胃组和母婴分离结合限水组 24h 进食量显着降低(P ＜0. 05) ; 母婴分离结合冰水灌胃组的 24 h 进食量显着低于冰水灌胃组(P ＜ 0. 05) ，但母婴分离结合限水组 24 h 进食量显着高于母婴分离结合冰水灌胃组(dP ＜ 0. 05) ，与限水组的 24 h 进食量差异无显着性(P ＜0. 05) 。

　　2. 1. 2 粪便相关评价

　　每组取 3 只大鼠解剖，观察各肠道粪便分布及形态。结果发现，A 组和 B 组大鼠回肠和结肠中可见呈软柱状大便，空肠中无明显粪便残留; C、D、E、F组大鼠粪便集中于结肠部，多呈连珠状或球状，色泽较深，空肠和回肠无明显粪便残留。

　　依据前期研究［8］，分别于造模结束后(第 36天) 随机抽取每组大鼠 10 只单独置于代谢笼中，禁水禁食，收集 4 h 内大鼠的粪便，记录 4 h 内排便颗粒数，根据 Bristol 大便性状图谱［2］记录大便形态，并按照中国药典附录烘干法测定粪便含水量。结果见表 1。

　　由表 1 可知，与 A 组比较，C、D、E、F 组大鼠的排便颗粒数显着减少(P ＜ 0. 05) ，Bristol 积分和粪便含水量均显着降低(P ＜ 0. 05) ; B 组大鼠的排便颗粒数、Bristol 积分和粪便含水量无明显变化，但波动较大，Bristol 积分体现出腹泻或便秘两种状态; 与B 组比较，C、D、E、F 组的排便颗粒数、Bristol 分型积分值和粪便含水量均显着降低(P ＜0. 05) ; C、D、E、F 组之间的粪便指标差异无显着性。结果提示，冰水灌胃法、限水法和母婴分离结合冰水灌胃、限水建立的模型均表现出排便颗粒数减少、粪便含水量下降及粪便分型积分降低等症状，符合便秘的临床特征。

　　2. 1. 3 肠道敏感性评价

　　于造模结束后第 36 天随机抽。取各组大鼠 10只，参考前期研究［8］，测定各组大鼠腹部回缩反射评分为 3 分时的压力阈值，每只大鼠测定 3 次，间隔5 min。结果见表 1。由表 1 可知，与 A 组比较，B、C、D、F 组的肠道压力阈值显着降低(P ＜ 0. 05) ，E组的压力阈值无显着改变(P ＞ 0. 05) ; 与母婴分离组比较，母婴分离结合冰水灌胃组的肠道压力阈值显着降低(P ＜ 0. 05) 。结果提示母婴分离法、冰水灌胃法、母婴分离结合冰水灌胃和母婴分离结合限水法均能导致肠道敏感性升高，限水法对肠道敏感性无明显影响，其中母婴分离结合冰水灌胃法的肠道超敏感性最为显着。

　　

　　2. 1. 4 结肠组织形态学观察

　　经解剖观察，C、D、E、F 组大鼠粪便多集中于结肠部，空肠和回肠较少，提示大鼠便秘状态可能与结肠组织功能改变有关。取各组大鼠的结肠 2cm，生理盐水洗净，浸入 5%甲醛溶液中，使用脱水机和包埋机对结肠标本进行石蜡包埋，切成 2 μm 厚度的切片，苏木素染色，置于光镜下观察。结果见图 1。

　　由图 1 可见，正常组、母婴分离组、冰水灌胃组、母婴分离结合冰水灌胃组结肠组织完整，未见糜烂及溃疡，杯状细胞形态和数量无显着改变，未见水肿及炎细胞浸润。限水组和母婴分离结合限水组结肠组织完整，未见糜烂和溃疡，杯状细胞和数量无显着改变，但可见中性粒细胞减少和少量炎细胞浸润。

　　2. 4 模型的验证

　　根据 2. 3 项下的模型评价结果，最终确定以母婴分离结合冰水灌胃法建立的大鼠模型为 IBS-C 模型。该 IBS-C 模型一般行为学表现出肝郁证和脾虚证的特点，具有排便颗粒数减少、粪便形态改变及粪便含水量显着降低等临床便秘的特征，肠道敏感性显着升高且肠组织无明显的病理改变，提示以该方法建立的模型能较高程度拟合 IBS-C 的临床特点，且表现出肝郁脾虚的中医证候特点。故采用具有疏肝解郁、理气健脾的名方逍遥散作为干预药物进行反证。

　　取乳鼠 3 窝 28 只，按照 2. 1 项下母婴分离结合冰水灌胃法建立 IBS-C 大鼠模型，并对模型进行评价，以排便颗粒数减少、粪便形态改变及粪便含水量显着降低，肠道敏感性显着升高的大鼠为成功的IBS-C 模型，计算造模成功率为 82% 。取符合要求的 IBS-C 模型大鼠 23 只，随机分为模型对照组和药物验证组。于造模结束当天，药物验证组每日给予逍遥散一包溶于3 mL 蒸馏水灌胃给药，模型组每天灌胃蒸馏水 3 mL，持续一周。另取一窝 14 只健康乳鼠不作任何处理，在模型组和药物验证组给药时同法灌胃蒸馏水 3 mL。分别测定给药结束后排便颗粒数、Bristol 积分、粪便含水量和肠道压力阈值，结果见表 2。

　　

　　由表 2 可知，与正常组比较，母婴分离结合冰水灌胃法建立的 IBS-C 模型大鼠的排便颗粒数、Bristol积分值、粪便含水量和肠道压力阈值均显着降低(P＜ 0. 05) ; 以逍遥散干预后粪便指标和压力阈值均显着升高(P ＜ 0. 05) ，且肠道压力阈值与正常组无显着差异。结果表明，具有疏肝解郁、益气健脾功效的逍遥散可较好的改善母婴分离结合冰水灌胃所致IBS-C 大鼠的排便异常和肠道超敏感性。结合该模型大鼠的一般行为学特征所表现的肝郁证和脾虚证，提示以母婴分离结合冰水灌胃所建立的 IBS-C模型符合中医肝郁脾虚证的特点。

　　3 讨论

　　目前的便秘模型主要有寒积型便秘、实热型便秘、燥结失水模型、气虚型、阳虚型、阴虚血瘀型、脾虚型和药物型［9，12，13］，但这些模型只能模拟出便秘的临床特征，不符合 IBS-C 的临床症状，且未能与IBS-C 的中医病因病机相符合，体现“肝郁脾虚证”相似的主要症状。本研究在分析和总结目前关于IBS 和便秘模型的基础上，从造模的思路、理论依据、观察指标等，考察了母婴分离法、冰水灌胃法、限水法和母婴分离结合冰水灌胃法、母婴分离结合限水法建立的便秘模型及其中医证候特点。

　　莫国强等［14］研究发现，母婴分离法可导致大鼠肠道敏感性增强，表现出类似肠易激综合征的肠道痛阈值降低反应，提示采用母婴分离结合目前的便秘模型造模方法或许可以诱导高拟合度的 IBS-C 模型。本研究结果显示，当初使用母婴分离法建立的模型具有肠道敏感性升高的特点，但其排便颗粒数、Bristol 分型积分和粪便含水量波动较大，呈现便秘、正常和腹泻三种状态。提示母婴分离能引起大鼠肠道痛阈值降低，使得排便出现异常，可能与大鼠脑-肠轴功能紊乱有关［11］。

　　大鼠有随时排便的习性，且其粪便形态和含水量与大鼠体重和饲料有关。为避免实验人为差异，本研究将各组大鼠喂以干燥的标准饲料，并单独饲养于代谢笼中使粪尿分离。本研究发现，以限水法制作的便秘模型肠道敏感性无显着变化，且结肠组织出现炎细胞浸润; 以母婴分离结合限水法制作的便秘模型虽然肠道敏感性显着升高，但结肠组织也出现炎细胞浸润。且对于采用了限水法的大鼠来说，干燥的饲料使其吞咽困难，表现为给水后进食，因而进食量和大便量影响较大，不易控制。因此，以限水法和母婴分离结合限水法制作的模型不符合IBS-C 的临床特征且稳定性较差。

　　研究发现，以母婴分离结合冰水灌胃建立的大鼠模型具有排便颗粒数减少、粪便形态改变及粪便含水量显着降低、肠道敏感性显着升高且肠组织无明显的病理改变的 IBS-C 临床特征，与文献报道一致［15，16］，又表现出易躁易怒、活动减少、进食量减少、形体消瘦特点，而采用具有疏肝解郁、理气健脾功效的逍遥散进行反证，发现肝郁脾虚证的症状有较大好转。本研究结果提示，提示采用母婴分离结合冰水灌胃法建立的大鼠模型属于肝郁脾虚证 IBS-C 模型。

　　参考文献：
　　［1］ 秦环龙，杨俊． 功能性肠病的多学科治疗 ［J］． 中国实用外科杂志，2011，31(1) : 50 －51．
　　［2］ 姚欣，杨云生，赵卡冰，等． 罗马Ⅲ标准研究肠易激综合征临床特点及亚型 ［J］． 世界华人消化杂志，2008，16(5) :563 － 566．