土壤有机碳分组方法的研究进展和趋势

　　土壤有机碳不仅是土壤肥力的核心和可持续农业的基础，而且是全球碳循环的重要组成部分。据估计，全球土壤表层总碳量为 2 100 Pg，其中有机碳库储量大约为 1 550 Pg，是大气碳库的 3 倍，陆地植被碳库的 2 ～ 4 倍。土壤有机碳是动植物和微生物残体在各个阶段降解物质的混合体，并且不同组分的有机碳不仅储存能力不同，而且生态服务功能亦有明显差异，所以建立科学合理的土壤有机碳分组方法，对于有效地区分和深入认识异质性的有机碳组分具有重要意义。

　　土壤有机碳的早期研究主要采用化学分组方法，通常基于土壤有机碳在各种提取剂中的溶解性、氧化性不同把有机碳分为活性和稳定性两个组分。相比之下，物理分组方法由于破坏性小而成为近些年来研究土壤有机碳组分的主流。其中，Six 等提出的团聚体 － 密度联合分组方法，因为较好地分离了游离活性有机碳、物理保护有机碳和矿物结合态有机碳组分，而被广泛应用。然而，该方法分离的矿物结合态有机碳组分仍存在较高的异质性，其中隐含了化学保护和生物化学保护有机碳组分。鉴于此，Stewart 等对前人的研究方法进行了改进，提出了物理 － 化学联合分组方法，该方法综合了其他分组方法的优点，并且在原理上将土壤有机碳稳定机制联系起来，进而成功地分离出物理、化学和生物化学保护等各种保护机制的有机碳组分。本文结合前期土壤有机碳分组方法的综述，以及近期发展的物理 － 化学联合分组方法，进一步系统论述土壤有机碳分组方法的研究进展和未来趋势，供相关研究借鉴。

　　1 化学分组

　　20 世纪 60 年代以前，国内外学者对土壤有机碳的研究主要集中在腐殖质类物质上，根据腐殖质类物质在酸、碱溶液中的溶解度不同可划分为 3 种不同的组分: 胡敏酸、胡敏素和富啡酸。其中胡敏酸是碱可溶、水和酸不溶; 富啡酸是水、酸、碱都可溶; 胡敏素则水、酸、碱都不溶。胡敏酸和富啡酸是腐殖质的主要组成部分。但是由于其腐殖化过程缓慢，短则几十年，长则上千年，且在全球范围内腐殖质的结构和功能没有明显差异，说明用土壤腐殖质的变化特征来反映一些农业措施具有一定的滞后性和无价值性，因此腐殖质分组方法在20 世纪80 年代后逐渐被淡出。目前土壤有机碳的化学分组主要根据化学溶剂的不同提取出溶解性有机碳、酸水解有机碳和易氧化有机碳等。1. 1 溶解性有机碳土壤溶解性有机碳是指能通过孔径为 0. 45 μm的滤膜的大小和结构不同的有机分子。其主要由碳水化合物、蛋白质、长链脂肪族化合物和大分子的腐殖质组成。测定方法: 将一定新鲜土样用盐溶液或水提取 ( 土液比一般为 1∶ 5) 后，用0. 45 μm 滤膜抽滤，然后滤液在碳氮分析仪上测定。通常采用的提取剂有水、CaCl2、KCl、K2SO4等。溶解性有机碳占土壤总有机碳的比例很小，一般不作为衡量有机碳质量的重要指标。但是它作为微生物生长的主要能源，在提供土壤养分方面具有重要作用。

　　1. 2 酸水解有机碳

　　酸水解作用主要是提取碳水化合物、糖、氨基酸和氨基糖等。其酸提取剂主要是硫酸和盐酸，测定方法有 H2SO4水解法和 HCl 水解法。H2SO4水解法: 称 1. 00 g 土样于消煮管中，加 20 mL2. 5 mol / L H2SO4，盖上小漏斗 105℃下油浴消煮 30min，转移至离心管中，在 4 500 r / min 离心 20 min，倒出上清液，再加入 20 mL 蒸馏水继续清洗离心，将两次上清液一起过 0. 45 μm 滤膜，该水解产物为活性组分 I，离心管内的残留物清洗离心数次后于60℃ 烘干，再加 2 mL 13 mol / L H2SO4转移至三角瓶，室温下震荡10 h，然后将酸稀释为1 mol/L 后，再在105℃下油浴3 h，再离心两次，将两次的上清液一起过 0. 45 μm 滤膜，此水解产物为活性组分Ⅱ; HCl 水解法: 称取 2. 00 g 过 2 mm 筛的风干土样于消煮管中，然后加入6 mol/L HCl 在115℃消煮 16 h，样品冷却后用蒸馏水洗至中性，烘干至恒重，测定碳含量，即为惰性有机碳，而酸解有机碳为总有机碳量减去惰性有机碳量。

　　酸水解有机碳分为活性有机碳库和惰性有机碳库，碳水化合物为活性有机碳，虽然其含量只占总有机碳的 10% ～20%，却是微生物的主要能源和碳源，并参与土壤团聚体的形成，是土壤有机碳和土壤性质研究中的重要指标和对象。

　　1. 3 易氧化有机碳

　　易氧化有机碳是利用化学氧化方法测定的活性有机碳，是土壤有机碳中不稳定的部分，其周转时间较短，是植物营养的主要来源，被称为土壤活性有机碳。常用的氧化剂有 K2Cr2O7和 KMnO4，其测定方法分别是 K2Cr2O7外加热法和 KMnO4氧化法。K2Cr2O7外加热法: 称取一定量的风干土样于硬质试管中，加入 5 mL 0. 800 0 mol/L 的 K2Cr2O7溶液和 5 mL 浓硫酸，放上小漏斗后于 170 ～180℃油浴锅中煮沸 5 min，取出后转移到三角瓶中，体积约 60 ～70 mL 为佳，加入指示剂后用标准的 0. 2mol / L 硫酸亚铁滴定。KMnO4氧化法根据 KMnO4不同浓度 ( 33、167 和 333 mmol/L) 氧化成 3 类不同的组分，即低活性有机碳、中活性有机碳和高活性有机碳，由于高活性有机碳对农业措施感应灵敏，而被广泛应用。其测定方法: 称取一定量的土壤样品于 30 mL 离心管中，加入 25 mL 333 mmol/LKMnO4溶液，震荡 1 h，在 2 000 r/min 的离心机下离心 5 min，将上清液用去离子水以 1∶ 250 稀释，然后在分光光度计 565 nm 下测定其吸光率，最后通过 KMnO4的浓度变化计算出易氧化有机碳的含量。

　　Lefroy 等和 Blair 等均把能被 333 mmol/L的 KMnO4氧化的有机碳称为活性有机碳，并利用碳库管理指数和活性指数计算出碳管理指数，具有突出的创新性。该氧化法简单，适于大批量样品的测定，但是仪器昂贵，对实验器皿清洁度和操作技术要求较高。

　　2 物理分组

　　土壤有机碳的物理分组是按照土壤有机碳的密度或土壤颗粒大小进行的分类。因其在分组过程中始终保持原状土状态且破坏性小而成为近些年来研究土壤有机碳组分的主流，主要包括密度分组、粒径分组、团聚体分组等方法。这些方法主要通过崩解、分散、密度离心和沉降可分离出不同活性的有机碳组分。

　　2. 1 密度分组

　　密度分组最早起始于20 世纪80 年代，是采用一定相对密度的溶液将土壤中相对密度较低的游离态有机物质和相对密度较高的有机无机复合体分离开来的过程，其中悬浮液为轻组有机碳 ( LF) ，沉淀部分为重组有机碳 ( HF)。其测定方法: 在离心管中加入一定量的重液，然后把待测样品轻轻地倾倒入其中，平衡20 min 后，在4 000 r/min 转速离心 20 min，溶液部分过 0. 45 μm 滤膜的布氏漏斗，把留在滤膜上的部分和离心管中的部分分别都转移到铝盒中，60℃烘干至恒重，再通过元素分析仪测定含碳量，其留在滤膜上的部分为 LF，而留在离心管中的部分为 HF。国际上采用的重液密度一般为 1. 6 ～2. 0 g/cm3，1. 7 g/cm3是目前比较通用的。

　　重液一般有卤代烃、溴仿 － 乙醇混合液、碘化钠、聚钨酸钠等，目前因碘化钠及聚钨酸钠能够避免样品中残留水的负效应以及表面活性剂和有机溶液在土壤组分上的吸附现象，且具有非常好的提取效果及较高的回收率而被广泛采用。

　　LF 分解速度快，C / N 值高，是介于新鲜有机质和腐殖质之间的中间碳库，包括微生物遗留残骸、动植物残体、菌丝体及孢子等。HF 主要成分是腐殖质，C/N 值低，分解及转化速度较慢。LF 的含碳量是土壤有机碳总量的 15% ～32%，由于其对农业措施反应敏感，常作为衡量土壤有机碳变化的重要指标。

　　2. 2 粒径分组

　　粒径分组的基础是土壤有机碳与不同土粒结合，导致有机碳的结构和功能不同。根据粒级大小不同将其分为 5 个组分: 砂粒 ( 53 ～ 2 000μm) 、粗粉粒 ( 5 ～ 53 μm) 、细粉粒 ( 2 ～ 5 μm) 、粗黏粒 ( 0. 2 ～ 2 μm) 和细黏粒 ( ＜ 0. 2 μm) 。其分组方法是佟小刚等根据 Anderson 等和武天云等的方法改进的: 称取10 g 过2 mm 筛的风干土样于 250 mL 的烧杯中，加 100 mL 水，于超声波发生器上超声 30 min，过 53 μm 筛，在筛上得到的是 53 ～2 000 μm 的砂粒组分，然后根据 Stockes 定律计算每个粒级颗粒分离的时间进行分离，通过不同的离心时间和离心速度分离得到 5 ～53 μm 的粗粉粒、2 ～5 μm 的细粉粒、0. 2 ～2 μm 的粗黏粒和＜ 0. 2 μm 的细黏粒。其中细粉粒和细黏粒悬液采用 0. 2 mol/L CaCl2絮凝，再离心收集，各组分转移至铝盒在 60℃烘箱中烘干至恒重，测碳含量即可。

　　砂粒中有机碳主要是植物残体，粉粒中主要是来自植物的芳香族物质为主，粘粒则主要是微生物产物。砂粒有机碳占总有机碳的 10%左右，分解程度快，C/N 值小，易转化; 粘粒有机碳占总有机碳的 50% ～70%，不易矿化，是土壤中的稳定碳库。

　　研究发现，砂粒组、粗粉砂粒组和细粘粒组中的有机碳是土壤有机碳的易分解碳库，而细粉砂粒组和粗粘粒组中的有机碳是土壤的惰性碳库。

　　2. 3 团聚体分组

　　自从 Tisdall 和 Oades提出土壤团聚化影响碳周转的概念模型后，对团聚体中有机碳的研究得到了广泛重视。土壤中的团聚体以 250 μm 为界分作大团聚体 ( ＞ 250 μm) 和微团聚体 ( ＜ 250 μm) ，进一步细分为 ＞ 2 000 μm、250 ～ 2 000 μm、53 ～250 μm 和 ＜ 53 μm 的 4 类团聚体。大团聚体是由多糖、作物根系和微生物菌丝体粘结了许多微团聚体后形成的集合体，而微团聚体主要由有机 － 矿质复合体组成。其测定方法: 称取过 5 mm 筛的风干土样，放在 2 mm 筛上，再放入 30 个直径为4 mm的玻璃珠，其下是 0. 25 mm 筛、0. 053 mm 筛，置于团聚体分离器中，通过恒定的水流分离 20 min，把留在水中的 ( ＜53 μm) 溶液离心，然后把留在筛上的土样分别置于铝盒中，于 60℃烘干至恒重，即得不同粒级的团聚体。

　　Six 等改进了原有的分离方法，把密度分组和团聚体分组结合起来，有效地分离出了留在团聚体间的游离态团聚体 ( fPOM) 和留在团聚体内部的闭蓄态团聚体 ( iPOM) 。其测定方法: 先经过原始的团聚体分组方法分出不同粒级的团聚体，然后经过密度分组法分出轻、重组分，把重组部分置于30 mL 5 g / mL 六偏磷酸钠中分散，在 180 r / min的震荡机上震荡 18 h，过 53 μm 筛，留在筛上的即为闭蓄态团聚体。该方法由于真实地反映了一部分有机碳在土壤中的转化过程和土壤质量的恢复过程而被广泛应用。

　　3 生物学分组

　　生物学分组主要是通过一定生物方法测定对已经矿化的生物和被矿化的有机残体的微生物生物量，或根据把有机碳作为一种底物的反应来推断出土壤中生物可利用的有机碳量。生物学分组方法把土壤有机碳分为微生物生物量碳和可矿化碳。

　　3. 1 微生物生物量碳

　　土壤微生物生物量碳是指土壤活的细菌、真菌、藻类和土壤微动物体内所含的碳。目前有许多方法可用来测定土壤微生物生物量碳，包括直接镜检法、三磷酸腺苷分析法、熏蒸培养法、熏蒸提取法、底物诱导呼吸法和磷脂脂肪酸法等，但是最常用的是 Jenkison 等提出的氯仿熏蒸法，即土壤用氯仿熏蒸后，在好氧条件下培养一段时间后，测定培养期间 CO2的释放量，根据熏蒸与未熏蒸土样释放 CO2量 的 差 值，计 算 土 壤 微 生 物 生 物 量 碳。

　　Brookes 等首次提出氯仿 － K2SO4浸提法，主要用于微生物量 N 和 P 的测定，后来 Vance 等把该方法用于测定微生物生物量碳，即土壤经过氯仿熏蒸后直接浸提碳含量，并测定生物量碳，测定后根据与熏蒸培养方法所测定的微生物量碳之间的关系，来计算土壤微生物生物量碳。与氯仿熏蒸培养法相比，氯仿熏蒸浸提法耗时短，方法成熟，简单方便，适于大批量样品的测定。

　　土壤微生物生物量碳在土壤中所占比例较小，一般只占土壤总有机碳的 0. 3% ～7%，但是微生物作为土壤代谢的直接参与者与分解者，是土壤中不可缺少的部分，土壤微生物生物量碳因对农业措施反映敏感而作为土壤活性有机碳。目前人们都把微生物生物量碳与土壤有机碳的比值用来监测有机碳的动态变化，并能指示土壤碳的平衡、积累或消耗。

　　3. 2 可矿化碳

　　有机碳的矿化过程实质上是有机质进入土壤后，在微生物和酶的作用下发生氧化反应，彻底分解而最终释放出 CO2、水和能量的过程。通常采用土壤培养法进行测定: 取一定量的土壤样品，放入密闭容器中，保持田间持水量，培养过程中微生物会释放出 CO2，根据需求选择培养时间，培养结束后，可以利用稀盐酸滴定法或气相色谱法测定微生物释放的 CO2含量，即可计算可矿化碳量。在实验过程中，一定要注意实验仪器的密闭性、培养过程的温度和湿度，这些因子是整个实验成功与否的关键。

　　4 物理 － 化学联合分组

　　Stewart 等在之前土壤有机碳物理分组方法基础上，联系土壤有机碳稳定机制，通过进一步引入化学分组，将湿筛、玻璃珠分散、重液浮选和酸解等技术手段有机结合起来，提出物理 － 化学联合分组方法。该方法成功地分离出了游离活性有机碳 库 ( cPOM、 fPOM ) 、 物 理 保 护 有 机 碳 库( iPOM) 、化学保护 有 机 碳 库 ( H － dSilt、H －dClay、H － μSilt、H － μClay) 和生物化学保护有机碳 库 ( NH － dSilt、 NH － dClay、 NH － μSilt、NH － μClay) 。土壤有机碳的物理保护，也叫空间不可接近性，是指由于土壤团聚体的闭蓄包裹等导致的有机碳底物与分解者和酶的隔离; 化学保护，也叫分子交互作用，是指高价铁铝氧化物和粘土矿物通过配位体置换、高价阳离子键桥、范德华力和络合作用等导致的有机碳的生物有效性下降;生物化学保护，也叫选择性保存，是指有机碳自身化学组成的抗降解性。这种分组方法由于综合考虑了土壤有机碳的各种稳定机制，所以已经引起人们的关注。

　　其操作程序可分为 3 步: 第一步，称取 20 g 过2 mm 筛的风干土样于微团聚体分离器套筛的顶部筛上 ( 上层 250 μm 筛子，下层 53 μm 筛子) ，放入 30 个玻璃珠，然后上下摆动此装置约 20 min，将留在 250 μm 和 53 ～250 μm 的组分转移至铝盒，而 ＜53 μm 的组分用离心法于不同转速下分离出游离粉粒组分 ( d － Silt) 和游离粘粒组分 ( d －Clay) ，所有组分 60℃ 烘干至恒重，大于 250 μm 的组分即为粗颗粒有机碳 ( cPOM) ; 第二步，在离心管中放入35 mL 1. 7 g/cm3的碘化钠溶液，然后将第一步得到的微团聚体部分 ( 53 ～ 250 μm 的组分)悬浮于离心管中，用手轻轻晃动，再用 10 mL 碘化钠冲洗离心管，20 min 后，在 4 000 r/min 转速离心 20 min，然后将液体部分过 0. 45 μm 滤膜，用0. 05 mol / L CaCl2和蒸馏水冲洗干净，转移到铝盒中60℃下烘干48 h，于0. 45 μm 滤膜上的组分为细颗粒有机碳 ( fPOM) 。留在离心管的沉淀部分同样要冲洗干净，然后在 60 mL 5 g/L 的六偏磷酸钠溶液中 ( 加 12 个玻璃珠) 震荡 18 h ( 180 r/min) ，过 53 μm 筛子，留在筛上的转入铝盒烘干，该部分为物理保护有机碳 ( iPOM) 。溶液部分用离心法进行分离，方法与第一步相同，分离出闭蓄粉粒组分( μ － Silt) 和闭蓄粘粒组分 ( μ － Clay) ; 第三步，将 ＜53 μm 的组分 ( d － Silt、d － Clay、μ － Silt、μ－ Clay) 加入 25 mL 6 mol / L 的 HCL 中于 95℃ 下回流加热 16 h，然后过滤，残留物质为非酸解部分，60℃ 烘干至恒重，即可得到生物化学保护有机碳组分 ( NH － dSilt、NH － dClay、NH － μSilt、NH －μClay) ，而酸解部分为全组分和非酸解组分之差，得到化学保护有机碳组分 ( H － dSilt、H － dClay、H － μSilt、H － μClay) 。

　　在土壤有机碳库中，游离活性有机碳库和物理保护有机碳库各组分有机碳由于分解速度快，周转时间短，对施肥响应敏感，可作为土壤碳库变化的早期指示指标; 而化学保护有机碳库和生物化学保护有机碳库各组分有机碳由于是惰性组分，对外界反应较迟钝，因而一般可作为预测土壤碳饱和与否的指标。

　　5 展望

　　随着国内外学者对土壤有机碳研究的不断深入，其分组方法也在不断的改进和完善。由于化学分组方法对土壤结构和形态的破坏性大，生物学分组方法所需培养时间长和限制因子要求高，物理分组方法存在较大的空间异质性，得到的组分之间有重叠等，所以导致研究结果无法进行比较和评估。

　　物理 － 化学联合分组方法改善了这些弊端，该方法不仅消除了生物学分组过程中培养所需时间长的困扰，还打破了各单一分组方法过程中出现的异质性组分重叠的现象，相比之下是更好的有机碳分组方法。但是，在物理 － 化学联合分组过程中，对样品进行酸解时还是沿用的盐酸溶液，具有一定的破坏性，而核磁共振技术通过固态13C 交叉极化魔角旋转技术分析有机物的烷基碳、烷氧碳、芳香碳和羰基碳等化学结构组成，能够实现有机物的原位不破坏分析和评价有机物的生物化学稳定性。所以，结合核磁共振分析的物理 － 化学联合分组，有望成为土壤有机碳分组方法的一个未来趋势。