黄瓜种质PI200815抗白粉病基因定位研究

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　　【题目】黄瓜白粉病基因的遗传与QTL定位研究
　　【第一章】黄瓜白粉病抗病基因探析绪论
　　【第二章】黄瓜种质PI200815抗白粉病基因定位研究
　　【第三章】黄瓜白粉病抗病基因的全基因组关联分析
　　【结论/参考文献】黄瓜白粉病抗性基因挖掘结论及参考文献

　　第二章 黄瓜种质 PI200815 抗白粉病基因定位研究

　　目前已有多篇报道对黄瓜白粉病抗病基因进行了遗传分析和定位研究，研究结果也各不相同。PI 200815 是一份起源于缅甸的抗白粉病种质材料，kooistra（1968，1971）对其抗性进行了遗传分析，认为其抗性由隐性单基因控制，截至到目前为止，尚未有关于这份抗病种质中抗病基因的定位研究。本实验利用 PI 200815 与一份感病材料（新泰密刺选系 931）进行杂交、自交构建遗传分离群体，对其抗病基因进行了遗传分析和定位研究。

　　2.1 材料与方法

　　2.1.1 实验材料

　　本实验所采用的研究材料由中国农科院蔬菜花卉所黄瓜课题组提供，母本 P1为高抗白粉病的纯合自交系 PI200815，果肉呈橙黄色，对白粉病表现为抗病。父本 P2是从栽培种新泰密刺中选育出的纯合自交系 931，属于典型的华北类型黄瓜，对白粉病表现为感病。以 P1、P2为亲本进行杂交，F1自交得 F2，收获 186 个 F2单株，F2继续自交获得 F3家系。

　　2.1.2 白粉病抗病性鉴定

　　2.1.2.1 材料准备

　　抗病鉴定于2013~2014年在中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室内进行。实验材料包括双亲、F1、F2及其 F2:3家系（186 份）。鉴定在 3 个季节进行：2013 年春季利用病圃对 F2进行成株期田间自然发病抗病鉴定（2013S），2014 年春季对 F2：3家系进行苗期人工接种抗病性鉴定（2014S）以及 2014 年秋季对 F2：3家系进行人工接种抗病性鉴定（2014A）。在实验 2013S 中，将 186 个F2单株育苗后定植于温室中。在实验 2014S 和 2014A 中，将 F2：3家系直接播种于营养钵内，分三次重复，每重复 5 株，随机区组排列。

　　2.1.2.2 菌源制备

　　白粉病苗期人工接种鉴定采用孢子悬浮液喷雾的接种方法。采集自然发病的黄瓜白粉病病株上的新发生的病叶，用毛刷刷取叶片典型病斑上的孢子（单丝壳白粉菌 Sphaerotheca fuliginea）于盛有无菌水的烧杯中、过滤，加入 SDS（1g/mL），高速搅拌 10 分钟，用血球记数法统计浓度，制备成浓度为 5×105/mL 的孢子悬浮液，用于接种。

　　2.1.2.3 接种、管理方法

　　在实验 2013S 中，采用病圃（该温室连年种植黄瓜，白粉病发生严重）田间鉴定，田间常规管理，所以无需进行人工接种，待其自然发病后，调查每株第 3~8 片真叶的病情级别，计算病情指数。在实验 2014S 和 2014A 中，幼苗于第三片真叶展平时，进行喷雾接种，用小型手持喷雾器将制备好的悬浮液均匀地喷于黄瓜叶片上，以叶片正反面有水滴流淌为度。接种后黑暗保湿（相对湿度为 78%~80%）12~16 小时，之后每天光照 14 小时，并不再保湿，温度一般控制在白天：25℃~28℃，晚上：20℃~22℃之间。

　　2.1.2.4 病情调查和数据处理

　　接种 15d 后调查发病情况。根据接种叶片上的发病情况进行病情评级，评级标准见表 1，计算病情指数（DI）。病情指数计算方法：病情指数=∑（每个病级的植株数×级别数）/（总植株数×最高级别数）×100，F2：3家系最终病指取三次重复的平均值。

　　黄瓜白粉病病情分级标准：

　　0 级：无病斑

　　1 级：病斑面积小于叶片面积 1/3

　　3 级：病斑面积大约介于叶片面积 1/3~2/3

　　5 级：病斑面积大于叶片面积 2/3，病斑连成片

　　7 级：白粉覆盖整个叶片，叶片开始变黄

　　9 级：叶片变褐，开始部分坏死，叶缘上卷

　　黄瓜白粉病群体抗性分级标准：

　　高抗（HR）： 0＜病情指数≤15；

　　抗病（R）： 15＜病情指数≤35；

　　中抗（MR）： 35＜病情指数≤55；

　　感病（S）： 55＜病情指数≤80；

　　高感（HS）： 病情指数＞80

　　对三次实验调查的病情指数进行整理分析，用 Microsoft Excel 2003 计算遗传参数并绘制频数分布图，分析后代分离规律，2.1.3 构建 SSR 连锁图谱。

　　2.1.3.1 黄瓜基因组 DNA 的提取

　　2.1.3.1.1 黄瓜材料的准备

　　采集双亲、F1和所有 F2单株叶片，提取其基因组总 DNA 放于-20℃冰箱内暂时储存，把各份材料在冷冻干燥机中进行干燥处理(约 24h)，冻干后将其搓成粉末，封口，放入低湿度储存柜内保存，待用。

　　2.1.3.1.2 DNA 提取

　　采用改良 CTAB 法提取样品全基因组 DNA，具体操作步骤见附录 22.1.3.1.3 基因组 DNA 浓度的检测。采用琼脂糖凝胶电泳对 DNA 浓度进行检测，具体操作步骤见附录 22.1.3.2 SSR 标记分析。

　　2.1.3.2.1 SSR 标记来源

　　基于国际黄瓜基因组测序计划设计的 2112 对 SSR 引物（任毅, 2009）。上述引物均由上海生物工程公司合成。用亲本对所有 SSR 引物进行筛选，完成后得到的多态性引物用于构建遗传图谱。

　　2.1.3.2.2 亲本筛选多态性 SSR 引物

　　首先用 2112 对 SSR 引物对双亲对进行筛选，找出具有多态性的引物。用所有在双亲上表现出多态性的引物对 F2群体进行 SSR 分析，构建遗传图谱，SSR 反应体系和程序见附录 22.1.3.2.3 凝胶电泳检测。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）对 PCR 产物进行电泳检测（凝胶浓度为 6%），显色采用银染法，详见附录 2。

　　2.1.3.2.4 PCR 扩增结果统计

　　按照作图软件（JionMap 4.0）的使用说明，对电泳条带进行统计和数据整理，具体方法见附录 2。

　　2.1.3.3 SSR 连锁群的构建

　　构建连锁群所使用的软件为 Join Map 4.0，先把 Excel 表中的原始数据进行处理，转化成软件中 F2群体所需格式，然后进行数据的处理和分析，详见附录 2。

　　2.1.4 黄瓜白粉病抗病基因的 QTL 分析

　　把整理好的 F2或 F2:3家系的表型调查结果用 Excel 整理，把其改为*.qua 文件格式保存。整理 JoinMap 4.0 作图软件的结果，把两者结果相相结合，采用 MapQTL 4.0 软件分析，以复合区间作图法(MQM)分别按不同季节进行白粉病抗性相关基因的 QTL 定位。详见附录 22.1.5 主要试剂、仪器设备。

　　实验中所用到的试剂和仪器参见附录 3

　　2.2 PI200815 抗病基因定位结果与分析

　　2.2.1 遗传群体抗病性鉴定结果

　　2013 年春，对双亲及 186 株 F2群体进行田间成株期抗病性鉴定（2013S）。结果显示，抗病亲本 P1的病情指数为 2.7，表现为高抗；感病亲本 P2的病情指数为 59.3，表现为感病；F1的病情指数为 38.7，介于双亲之间。F2群体中病情指数呈现连续分布，这表明，抗病亲本中含有的抗白粉病性状可能是由数量基因控制。

　　2014 年春和 2014 年秋，对双亲和 186 株 F2对应的的后代 F2：3家系进行了苗期人工接种抗病性鉴定（2014S 和 2014A），在 2014S 中双亲鉴定结果与 F2结果基本一致，感病亲本 P2病情指数达到 52.3，表现为感病，而抗病亲本为 2.4，仍然表现为高抗。在实验 2014A 中，结果类似。

表 2.1 P1、P2、F1、F2和 F2：3家系三次抗病性鉴定病指分布

图 2.1 F2或 F2：3群体病情指数分布图

　　2.2.2 SSR 多态性分析

　　采用 PAGE 技术筛选在双亲间表现为多态性的引物，从黄瓜基因组测序后开发的 2112 对 SSR引物有中 129 对引物在两亲本间有多态性且扩增条带清晰的引物，部分 SSR 引物在亲本间的扩增情况见图 3.2。

图 2.2 SSR 引物在亲本 P1（PI200815）和 P2（931）间的扩增结果

　　2.2.3 遗传图谱的构建

　　将筛选出的 129 对引物，在 F2群体上进行扩增分析并用 Jionmap 软件构件连锁图谱。获得了一张包含 8 个连锁群的遗传图谱，可与黄瓜 7 条染色体一一对应（其中两条连锁群均对应到 3 号染色体上）。这个遗传图谱公包含 129 个 SSR 标记。这张遗传图谱的总长度为 857.9cM，标记间的平均遗传距离为 6.65cM。表 2.2 中列出每条染色体上标记的分布情况。

表 2.2 遗传图谱上 SSR 分子标记分布情况

图 2.3 黄瓜 F2群体 SSR 遗传图谱

　　2.2.4 黄瓜抗白粉病 QTL 定位分析

　　我们利用三年的抗性鉴定结果和构建的遗传图谱，利用 JionMap 4.0 的复合区间作图法作图法（MQM），对白粉病抗性基因进行了 QTL 定位分析，结果如下：2013S 中，分别在黄瓜 Chr1、Chr6 上检测到 1 个 QTL 位点：pmQTL1.1 和 pmQTL6.1，pmQTL1.1的 LOD 值为 4.6，表型解释率为 10%；其位于标记 SSR03860-SSR14445 之间，两侧翼标记之间的遗传距离为 2cM。pmQTL6.1 的 LOD 值为 3.31，表型解释率为 7%，其位于标记SSR18251-SSR01148 之间，两侧翼标记之间的遗传距离为 7.3cM。2014S 和 2014A 中，只检测 pmQTL1.1，LOD 值分别达到了 15.3 和 4.9，表型解释率分别为37.9%和 21.6%（详见表 2.3）。

表 2.3：三次实验对白粉病抗性的 QTL 定位结果

　　综合表中数据可以看出，只有 pmQTL1.1 这个 QTL 位点可以被重复检测到。且 LOD 值较高，即可信度较高，表型解释率也达到了 37.9%。pmQTL6.1 只有在成株期（2013S）抗性鉴定的结果中检测到。

图 2.4 黄瓜白粉病抗性基因的 QTL 定位

图 2.5 白粉病抗性基因的 QTL 分析(坐标轴上的线改用黑色)

　　2.2.5 主效 QTL 区域基因预测

　　利用黄瓜全基因组测序（Huang et al.，2009）提供的基因组预测、注释结果，对黄瓜白粉病抗性相关的主效 QTL（pmQTL1.1）所在区域进行了序列比对和分析。发现目标区域两侧翼标记分别为 SSR03860 和 SSR14445，他们直接的物理距离为 689Kb，共有 95 个预测基因。其中包括：

　　转录因子，细胞分裂周期蛋白，糖类转运蛋白，脱氢酶，超氧化物歧化酶等多种功能的基因，其中还有 10 个基因与抗性直接相关：2 个 NBS-LRR 类型抗病蛋白，5 个紧挨着的抵御素类似基因，2 个逆境调控的蛋白，1 个调控植物细胞程序性死亡的基因。（详见表 2.4）

表 2.4 黄瓜白粉病幼苗抗性相关基因的预测结果

　　2.3 讨论

　　黄瓜是全世界范围广泛栽培的一种蔬菜，白粉病是黄瓜生产上重要的病害，常造成严重的经济损失，所以国内外专家学者对黄瓜白粉病抗病基因进行了诸多研究。在遗传分析方面存在诸多不同的观点。造成这种现象的主要原因可能有以下几点：1、专家学者选用的研究材料本身抗病基因不同。例如 Kooistra（1968）经遗传分析认为 Natsufushinari 中含有两个白粉病抗性基因，而 PI 200815 中含有第三个抗白粉病基因。2、不同学者研究时所采用的抗病鉴定方法不同，如环境的温度湿度不同、病情调查方法不同等。3、白粉菌的生理小种不同。

　　本实验通过抗感双亲构建遗传群体，并且构建了覆盖全基因组的遗传图谱，对白粉病抗性基因进行 QTL 定位研究，在三个季度实验中，检测到一个稳定的主效的 QTL 位点，表型解释率最高达到了 37.9%，LOD 值也达到 15.3。Kooistra（1968）曾报道认为 PI200815 中白粉病抗性为隐性单基因控制，后来被命名为 pm-3 基因。这与本实验的结果有一定的一致性，本实验只定位到一个主效 QTL，且表型解释率很高，所以我们推测本研究定位到的 QTL 位点 pmQTL1.1 就是前人报道的 pm-3 基因。

　　在模式作物中，白粉病的抗性基因有很多已被克隆，这些已克隆的基因可以为挖掘黄瓜中的抗病基因提供参考。利用同源基因的相似性，在黄瓜中搜索抗病基因的同源基因。目前研究较多的有 MLO 家族基因和 PMR 家族基因。这些基因可以作为定位结果的候选基因进行预测或者直接进行转基因进行功能验证。