人脂肪间充质干细胞体外分离培养方法

　　大面积皮肤缺损、重度烧伤的传统修复方法-自体或异体皮肤移植，因存在免疫排斥和供区不足等缺陷而限制了广泛临床应用。近年来，干细胞相关机制及应用的研究为皮肤创伤的治疗带来了新突破。研究显示，间充质干细胞能维持皮肤稳态和促进皮肤创面修复，其机制包括促进细胞分化、免疫调节和分泌生长因子来促进创面再上皮化和血管形成[1 -2].人脂肪间充质干细胞（ human adipose - derived mesenchymal stem cells,hAD-SCs） 是由 Zuk 等[3]首次从抽脂术脂肪中分离出的一类具有多向分化能力的细胞群，因其具有来源丰富、容易获取和扩增快等优点，是组织工程的理想种子细胞。本实验旨在提供一种有效的 hADSCs 体外分离培养方法，为以后临床细胞移植提供实验基础。

　　1 材料与方法

　　1. 1 材料 成人腹部大网膜脂肪组织 7 例取自江苏大学附属医院产科剖宫产手术患者，年龄 17 ~33 岁，平均为 26 岁，健康状况良好，无系统性疾病。低/高糖DMEM、Ⅰ型胶原酶（ Gibco 公司） ,胎牛血清（ Hyclone 公司） ,鼠抗人单克隆抗体 CD29 - FITC、CD44 - FITC、CD45 - FITC、CD73 - FITC、CD90 - PE、CD105 - PE、CD166 - PE、HLA - DR - PE 及其相应同型对照（ eBio-sciences 公司） ,地塞米松、抗坏血酸磷酸盐、β - 甘油磷酸钠、吲哚美辛、3 - 异丁基 -1 - 甲基黄嘌呤（ IBMX） 、胰岛素（ Sigma 公司） .

　　1. 2 方法
　　
　　1. 2. 1 hADSCs 细胞分离培养 产科无菌条件下取出腹部大网膜脂肪组织约 10 ml,PBS 清洗，剪碎，0. 1% Ⅰ型胶原酶 37℃消化 45 min,10% 胎牛血清终止消化，离心，沉淀重悬，200 目细胞筛过滤，再离心。加入完全培养液（ 含 10% 胎牛血清、1 × 双抗的低糖 DMEM） 重悬，以 5 ×104/ ml 接种于 6 孔板，置于 37℃ ,5% CO2培养箱中培养，48 h 后首次换液，之后每周换液 2 次，待细胞生长至 80% 融合时，0. 25% 胰酶 - 0. 02% EDTA 消化传代。实验时用第 3 ~9 代细胞。

　　1. 2. 2 细胞免疫表型检测 取消化消化贴壁的第 3 代hADSCs,1 000 r / min 离心 5 min,用 PBS 重悬分装于 1. 5ml 的 EP 管中，每管 100 μl,细胞密度为 105/ ml,加入鼠抗人 CD29、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166E、HLA - DR 等单克隆抗体及其同型对照。4℃ 避光孵育30 min,PBS 洗 2 次，加 PBS 300 μl 重悬后流式细胞仪检测细胞表面抗原。
　　
　　1. 2. 3 细胞生长曲线和倍增时间 取处于对数生长期的第 3、6 和 9 代细胞，消化贴壁细胞，将细胞按 5 ×103/孔接种于 24 孔板，分 7 组，每组 3 孔，置培养箱培养。每24 h 用台盼蓝计数一次，每次计3 孔，取其平均数； 连续计数 7 d,将所得数据以天数为横坐标，细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。hADSCs 细胞倍增时间按 Patter-son 公式计算[4].

　　1. 2. 4 成脂和成骨分化鉴定 将 80% 融合的第 3 代hADSCs 分别改用成脂诱导培养基（ 含 10% 胎牛血清、1× 双抗、0. 5 mM 3 - 异丁基 - 1 - 甲基黄嘌呤、1 μM 地塞米 松、10 μM 胰 岛 素、200 μM 吲 哚 美 辛 的 高 糖DMEM） 和成骨诱导培养基（ 含 10% 胎牛血清、1 × 双抗、0. 1 μM 地塞米松、50 μM 抗坏血酸磷酸盐、10 mM β -甘油磷酸钠的高糖 DMEM） ,诱导 14 d 后分别油红染色鉴定脂滴和 Von Kossa 染色鉴定钙结节。

　　1. 3 统计学分析 以 SPSS 17. 0 统计软件对实验数据进行方差分析。当 P <0. 05 时为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2. 1 hADSCs 细胞分离培养 接种 48 h 后可见散在贴壁细胞，呈圆形或梭形，换液除去非贴壁细胞； 一般培养7 ~ 8 d 达到 80% 以上融合，细胞形态逐渐均一，排列趋于方向性，呈放射状或河流状； 3 ~9 代的细胞形态无明显改变。

　　2. 2 细胞免疫表型检测 通过流式检测 hADSCs 多个细胞表面分子标记物，结果显示 CD29、CD44、CD73、CD90、CD105 和 CD166 表达均在 95% 以上，CD45 和HLA - DR 表达均在 5% 以下。
　　
　　2. 3 细胞生长曲线和倍增时间 生长曲线显示 hADSCs接种后前 2 d 处于“潜伏期”生长较慢，从第 3 d 开始进入对数生长期呈“S”形，约在接种第 6 天进入平台期停止增殖，第3 代细胞倍增时间为 27.4 h,不同代数细胞增殖能力无显着差异（ 各培养天数 F 值分别为 0.14,0.03,0.78,1. 14,0. 20,0. 18,0. 18,对应 P > 0. 05） .见图 2.【1】

　　
　　2. 4 成脂和成骨鉴定 hADSCs 在成脂诱导环境下，14d 诱导结束油红染色，可见成脂细胞内较多鲜红色的脂滴。在成骨诱导环境下，14 d 诱导结束 Von Konssa 染色，可见分别染成黑色的钙结节，未诱导组均阴性。
　　
　　3 讨论

　　间充质干细胞属于成体干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪和脐带等组织，其中脂肪间充质干细胞（ ADSCs） 因来源广泛、对供体损伤小和体外培养扩增快等优点，是继骨髓间充质干细胞之后又一研究热点。ADSCs 在体外可以定向分化成中胚层来源的脂肪细胞和骨细胞[3],内胚层来源的内皮细胞[5],甚至外胚层来源的神经细胞[6].此外，有研究显示黑素细胞与 hADSCs 共培养后移植于裸鼠皮肤，黑素细胞存活时间延长且皮肤色素沉着更明显[7].

　　目前 ADSCs 的分离、培养和鉴定尚缺乏标准化的方法。本实验通过 0. 1% 的胶原酶消化法，从脂肪组织分离得到的 hADSCs 形态和其他来源的间充质干细胞形态非常相似，经多次传代后细胞形态仍呈均一的梭形。本实验通过对细胞生长曲线和倍增时间的研究发现 9 代以内的 hADSCs 细胞增殖能力旺盛，细胞倍增时间短，与前期研究保持一致[8].

　　间充质干细胞尚无特异性的表面标记物，多分子标记物同时检测有助于细胞纯度鉴定。本实验流式检测结果发现，分离得到的 hADSCs 细胞高表达间充质干细胞分子如 CD29、CD44、CD73、CD90、CD105 和 CD166等，几乎不表达造血系分子如 CD45 和 HLA - DR,满足国际细胞移植学会对间充质干细胞定义的基本标准[9].多向分化能力是间充质干细胞的另一个重要指标，油红染色可鉴别脂肪细胞质中的脂滴[10],Von Kossa 染色可鉴别成骨细胞外基质中钙结节[11].本实验显示，hAD-SCs 在成脂和成骨诱导培养 14 d,分化的细胞分别油红和 Von Kossa 染色呈阳性进一步证实了分离的 hADSCs和骨髓间充质干细胞具有类似的多向分化能力。

　　4 结论

　　本研究成功地从人脂肪组织中分离且能稳定传代的 hADSCs,并通过体外实验验证了 hADSCs 的间充质干细胞生物学特性，建立了完整而有效的体外分离培养hADSCs 方法，为今后作为种子细胞用于组织工程提供了实验支持。值得注意的是，在实际应用中细胞移植后存活率及安全性仍有待进一步的研究来证实。

　　参考文献
　　
　　[1] Fuchs E,Horsley V. More than one way to skin[J]. Genes Dev,2008,22（ 8） : 976 - 985.
　　[2] Balaji S,Keswani SG,Crombleholme TM. The role of mesenchymalstem cells in the regenerative wound healing phenotype[J]. Adv WoundCare,2012,1（ 4） : 159 - 165.
　　[3] Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al. Multilineage cells from human adi-pose tissue: implications for cell - based therapies[J]. Tissue Eng,2001,7（ 2） : 211 - 228.