巨噬细胞中circRNA的意义

　　摘    要：　环状RNA（circular RNA, circRNA）是一类特殊的非编码RNA类型，在真核生物细胞和人体转录本中大量存在。circRNA是由前体信使RNA（pre-mRNA）反向剪接形成的共价闭合环状RNA分子，通过充当微核糖核酸（microRNA, miRNA）“海绵”、与蛋白质结合、参与基因转录调控和蛋白质翻译等发挥其生物学作用。随着对circRNA研究的日益增多，已有研究人员报道了circRNA在免疫细胞中的作用。现对circRNA的形成、分类、生物学特性、功能及其在巨噬细胞中的作用作一概述。

　　关键词 :     环状RNA;巨噬细胞; miRNA;脂多糖;免疫细胞;

　　Abstract：　Circular RNA (circRNA) is a novel class of non-coding RNA generated by back-splicing of pre-mRNA, which is characterized by a closed-loop structure. Evidence implicated that circRNAs are abundant in eukaryotic cells and human transcripts, and play critical roles in biological functions, in particular, they are acted as miRNA- sponges, bind to proteins, participate in gene transcription regulation and protein translation, etc. With the increasing studies on circRNA, researchers have identified the role of circRNA in immune cells. The following is an overview of the formation and classification of circRNA, meanwhile its biological properties, functions, and role in macrophages are also introduced here.

　　Keyword：　Circular RNA(circRNA); Macrophages; miRNA; Lipopolysaccharide(LPS); Immune cell;

　　20世纪70年代，环状RNA（circular RNA, circRNA）在植物感染的病毒中被发现[1]。最初，由于异常的闭合环状结构，circRNA被误认为是基因转录过程中剪切错误导致的副产物。然而，随着现代生物学和生物检测技术的发展，发现circRNA在真核细胞内广泛存在且大量表达，具有重要的生物学功能。circRNA具有稳定性、保守性、丰度以及组织和阶段特异性，没有5′端帽子和3′端多聚A尾结构，可以抵抗核糖核酸酶（ribonuclease, RNase）的降解作用并稳定存在[2]，可以作为理想的生物学标志物。了解circRNA在巨噬细胞中的作用及其机制，能够为巨噬细胞相关疾病的诊断和治疗提供新方案[3]。现对circRNA的形成、分类、生物学特性、功能及其在巨噬细胞中的作用作一概述。

　　1、 circRNA的形成和分类

　　circRNA是一类特殊的非编码RNA类型，由前体信使RNA（pre-mRNA）转录产物的非顺序反向剪接形成共价闭合环状RNA分子，与传统的线性RNA（linear RNA，含5′端帽子和3′端多聚A尾结构）相比，其表达更稳定，不易降解 [2,4]。circRNA形成的主要方式是反向剪接，这是一种新型选择性剪接形式，通过反向剪接将下游剪接供体与上游剪接受体反向连接，形成闭合circRNA转录本。circRNA的形成主要取决于顺式作用元件和反式作用因子。目前报道的形成机制有内含子配对驱动环化、套索驱动环化、内含子自身环化和RNA结合蛋白驱动环化[5]。在内含子配对驱动环化机制中，pre-mRNA中临近的内含子互补配对，诱导下游外显子序列反向接近上游外显子序列，从而发生了部分重叠，然后直接进行内含子剪切，切除剩余内含子后形成环状RNA；套索驱动环化机制中，在可变剪切过程中产生1个线性RNA和1个包含外显子的内含子套索，后者形成过程中外显子跳跃，pre-mRNA的下游外显子3’剪接供体与下游外显子的5’剪接受体连接，形成套索结构后切除内含子，从而促进序列成环；内含子自身环化主要存在于特定的组织细胞中，具有少量的miRNA靶点[6,7]。

　　根据母体基因来源不同可将circRNA分为3类：外显子来源的外显子环状RNA（exonic circRNA），内含子来源的内含子环状RNA（intronic circRNA）以及外显子和内含子共同来源的外显子-内含子环状RNA（exon-intron circRNA, EIciRNA），这些circRNA分子之间存在着竞争性平衡关系，可以影响mRNA的表达[8,9]。

　　2 、circRNA的生物学特性和功能

　　2.1 、参与基因转录调节

　　研究显示，circRNA的表达量可以影响其亲本基因mRNA的剪接。如circ -Mbl调节其亲本基因pre-mRNA的剪接，circ-Mbl含有甘露糖结合凝集素（mannose-binding lectin, MBL）蛋白的结合位点，MBL基因表达的MBL蛋白可以与MBL特异性结合，能够影响游离MBL蛋白的浓度[10]。circ-Mbl与MBL的pre-mRNA之间存在剪切竞争，当游离的MBL蛋白浓度较高时，MBL基因中内含子、外显子的环化依赖于MBL蛋白含量，MBL蛋白促进pre-mRNA第二外显子进行环化形成circ-RNA[11,12]，而circRNA又能与MBL蛋白结合抑制MBL的活性，降低自身mRNA的合成，从而在基因转录水平中起到调节作用[13]；反之浓度较低时，pre-mRNA会进行经典的线性剪接从而调节基因转录[10]。然而，内含子来源的circRNA通常驻留在细胞核内，已有研究报道核内circRNA可以与RNA聚合酶Ⅱ复合体（PolⅡ）结合促进基因转录。源于ANKRD52基因第2个内含子区域的circRNA ci-ankrd52通常聚集在细胞核中，可以通过与RNA PolⅡ的相互作用，促进亲本基因ANKRD52的转录[14]。在人子宫颈癌Hela细胞中，circEIF3J和circPAIP2可以与抗U1小核糖核蛋白抗体（U1 snRNP）相互作用形成复合物，并促进亲本基因EIF3J和PAIP2的转录[15]。

　　2.2 、充当miRNA“海绵”

　　circRNA有丰富的miRNA结合位点，能够内源性竞争结合特定的miRNA，调节miRNA和mRNA的结合，从而影响miRNA靶基因的表达。含有miRNA结合位点的circRNA能够通过碱基互补配对原则海绵样吸附miRNA，从而解除了miRNAs对靶基因表达的调控作用[16]。CDR1as是最早发现具有miRNA海绵样作用的circRNA，与多种癌症和神经性疾病的发生密切相关，具有丰富的miR-7(一种microRNA)结合位点，对miR-7能够起到负调控作用。由于circRNA可以通过充当miRNA的“海绵”，影响miRNA发挥作用，因此，可以利用这一特点，在免疫系统受损后“克隆”分子海绵，替代原本能够发挥免疫调节效应的circRNA[17]。

　　2.3 、参与蛋白质翻译作用

　　虽然circRNA被定义为非编码RNA，但有研究表明，circRNA分子可以通过募集其内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）序列，使其在细胞内被翻译。WANG等[18]采用基因编辑的方法证明了含有IRES的circRNA能够翻译产生多肽，而不含IRES的circRNA则不能翻译产生多肽。通过核糖体印记分析发现，果蝇中含有大量具有翻译功能的circRNA[19]。目前，已经有越来越多的实验证实环状RNA具有翻译的功能，但关于其翻译功能仍需进一步研究。

　　2.4、 circRNA与蛋白质的相互作用

　　circRNA与RNA结合蛋白质（RNA-binding protein, RBP）相互作用可以实现对蛋白质的调控，也可以动态调控circRNA形成等过程[20]。有研究表明，circRNA能与MBL[10]、安格蛋白(argonaute,AGO）[15]和TAR DNA结合蛋白43（TAR DNA-binding protein of 43 kDa, TDP-43）[21]等RBP相互作用，竞争结合位点，从而干扰靶基因转录。此外，circRNA也能够直接编码蛋白质。ABOUHAIDAR等[22]研究发现，circRNA上有核糖体插入位点，可以直接编码蛋白质。在转基因果蝇体内，circ-Mbl能够编码相对分子质量为10 000的蛋白质[23]。circRNA在肌细胞差异表达的circRNA上有开放阅读框架，可以影响肌细胞，并且可以翻译生成蛋白质[24]。以上研究均提示，circRNA具有编码蛋白质的作用。

　　3 、circRNA与巨噬细胞

　　巨噬细胞是一类非常重要的免疫细胞，也是机体固有免疫的重要组成部分。在机体中，巨噬细胞发挥着促炎和抗炎双重作用，而在巨噬细胞中，circRNA表达丰富，并参与调控巨噬细胞的促炎和抗炎作用[25,26]。受到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、降钙素基因相关肽（calcitonin generelated peptide, CGRP）、二氧化硅（SiO2）等特定因素刺激后，巨噬细胞中的circRNA发挥特异性作用，如小鼠巨噬细胞受LPS刺激后特异性表达circRNA[25,26,27,28]、circRNA在CGRP诱导的巨噬细胞中表达IL-6[29,30]、circRNA参与SiO2诱导的巨噬细胞活化[31,32,33,34,35,36,37,38]等。以上研究提示，circRNA能够通过影响巨噬细胞的作用而调节刺激因子的作用，也可以影响相关多肽的作用，甚至可以通过SiO2直接在疾病中发挥作用。

　　3.1、 circRNA与LPS

　　鼠源性mcircRasGEF1B（RasGEF1B circularRNA）参与调节LPS诱导的小鼠巨噬细胞激活。LPS诱导的circRNA-mcircRasGEF1B与人类同源物hcircRasGEF1B具有相似性质，分别在鼠和人体中保守存在。LPS诱导小鼠巨噬细胞产生mcircRasGEF1B，mcircRasGEF1B能够正向调控Toll样受体4（toll-like receptors 4, TLR4）/LPS信号通路中细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule1, ICAM-1）抗体的表达，即下调mcircRasGEF1B的表达，可以降低LPS诱导的ICAM-1的表达；此外，mcircRasGEF1B也能通过调节成熟的ICAM-1 mRNA的稳定性，正向调节ICAM-1的表达，从而正向调控LPS诱导的免疫反应[25,26]。在LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞炎症反应中，通过检测mmu_circ_0000790发现，LPS刺激的巨噬细胞中mmu_circ_0000790表达水平明显上调；而在转染si-mmu_circ_0000790后，白介素6（interleukin-6, IL-6）的水平明显降低。LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞炎症反应后，circRNA表达谱发生显着变化，表明mmu_circ_0000790可能会影响巨噬细胞分泌IL-6的水平[27]。在巨噬细胞的固有免疫中，LPS刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞，miR-350表达水平下调，并且呈时间依赖性。若在小鼠原代腹腔中抑制miR-350的表达，给予LPS刺激后IL-6表达上调；反之，过表达miR-350，IL-6则下调。该结果表明，在LPS诱导的固有免疫信号通路中，miR-350表达下调能够显着抑制促炎因子的表达[27,28]。上述研究均提示，circRNA在微调免疫应答反应和固有免疫应答中发挥至关重要的作用。

　　3.2 、circRNA与CGRP

　　CGRP神经纤维在心血管系统广泛存在，并且CGRP受体含量也很高，在心房、心室、冠脉、肠系膜上动脉以及股动脉等均含有CGRP受体。CGRP的分布与心血管紧密联系，是调节心血管相关活动的重要肽能神经纤维。CGRP能够通过circRNA_007893诱导RAW264.7巨噬细胞表达IL-6。DENG等[29]研究发现，mmu_circRNA_007893在CGRP刺激的巨噬细胞中显着升高。沉默mmu_circRNA_007893，IL-6 mRNA表达显着降低，而mmu-miR-485-5p表达显着升高。此外，mmu-miR-485-5p过表达时，IL-6mRNA明显降低。研究结果表明，mmu_circRNA_007893介导了CGRP诱导的IL-6 mRNA的表达，mmu_circRNA_007893作为内源性mmu-miR-485-5p“海绵”参与了IL-6 mRNA表达的诱导，提示circRNA在CGRP诱导巨噬细胞表达IL-6过程中起到了关键作用[30]。

　　3.3 、circRNA与肺纤维化

　　矽肺是由于长时间吸入大量含有游离SiO2的粉尘所引起的疾病，其病变原因尚不清楚，主要认为是上皮间质转化导致肺纤维化改变。在矽肺患者的细胞中，SiO2被肺细胞吞噬后，会引起炎症级联反应，导致纤维细胞增殖和迁移，随后引发肺纤维化[31]。通过研究circRNA在细胞凋亡、增殖以及迁移中的上游分子机制和功能作用，发现在特发性肺纤维化患者的血浆中，存在大量circRNA的表达失调[32]。ZHOU等[33]已报道了circHECTD1 在SiO2诱导的巨噬细胞活化和肺纤维化中的作用。研究发现，SiO2增加circHECTD1但是抑制HECTD1蛋白表达，来自SiO2暴露的小鼠和矽肺患者的肺样品同样证实了HECTD1蛋白的减少，提示SiO2诱导的巨噬细胞活化能够通过circHECTD1/HECTD1通路来调节[33,34]。此外，有研究表明，circZC3H4RNA和ZC3H4蛋白也参与了SiO2诱导的巨噬细胞活化[35]，SiO2通过启动circZC3H4RNA/ZC3H4途径促进了诱导肺巨噬细胞的活化[36]。circRNA HIPK3是人成纤维细胞中含量最丰富的circRNA之一，在肺组织纤维化的小鼠肌成纤维细胞中，circRNA HIPK3可以导致肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化以及巨噬细胞活化，并且沉默circRNA HIPK3能够抑制成纤维细胞增殖[37]。上述研究提示，circRNA以多种方式参与肺纤维化病理过程中的肺巨噬细胞炎症反应，从而调节肺纤维化的形成。通过对其病理过程中巨噬细胞的相关研究，有望为肺纤维化临床治疗提供新的治疗方案，从而延长患者寿命，降低患者的死亡率[38]。

　　3.4、 circRNA与其他

　　研究发现，在氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, ox-LDL）刺激巨噬细胞生物学活动中存在circRNA的差异表达[39]。ox-LDL刺激单核细胞源性巨噬细胞构建巨噬细胞炎症模型，芯片结果显示，除1条circRNA无变化外，其余有4条在ox-LDL刺激后的巨噬细胞中表达上调，2条表达下调。基于实验结果分析，在ox-LDL刺激的巨噬细胞中，circRNA的功能与炎症、细胞因子及信号通路调节密切相关，说明circRNA在ox-LDL刺激下的巨噬细胞炎症反应中具有重要作用。此外，巨噬细胞在受到病原体微生物刺激后也会特异性表达circRNA，如人单核细胞源性巨噬细胞感染结核分枝杆菌后circRNA显着差异性表达[40]。

　　4 、结 语

　　circRNA是一类特殊的新型非编码RNA分子，其生物学功能和作用是非编码RNA领域的研究热点。然而，目前只有少部分的circRNA被发现，并且其中大部分是由于RNA剪切错误而产生的，它们的生物学作用以及具体调控机制仍需深入研究。

　　随着生物信息学和高通量测序技术的发展，人们发现circRNAs在自身免疫病[27,28]、肿瘤[41,42]和神经性疾病等诸多疾病中异常表达。此外，circRNA由于其独特的环形结构表达更加稳定，并且不受RNA外切酶影响，不易降解，有望成为上述疾病的潜在诊断和治疗靶点，从而提高诊断和治疗的准确性和特异性。随着研究的持续深入，相信circRNA在免疫细胞中的作用也会得到进一步的揭示。

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