探讨接种紫外线致弱六钩蚴诱导的免疫保护力

　　亚洲带绦虫(Taenia asiatica)感染在我国西部农牧地区存在局部流行,由于其病原体主要通过人生食受感染的猪肝或野猪等动物的内脏进入人体,危害极大。目前,针对亚洲带绦虫感染的预防主要采取综合防治措施,尚未见应用疫苗预防亚洲带绦虫感染的报道。本研究通过观察乳猪接种UV致弱六钩蚴后血清IgG、脾淋巴细胞分泌细胞因子变化及虫卵攻击感染试验,探讨UV致弱六钩蚴诱导的免疫保护力,为应用疫苗预防亚洲带绦虫感染提供理论依据。

　　材料与方法

　　1．实验动物20d龄杜洛克长白三元杂交乳猪,11头,购自都匀市种猪繁殖场,经粪检、驱虫和间接血凝试验证明无囊尾蚴感染。

　　2．亚洲带绦虫采集以口服槟榔、南瓜子法,对贵州省都匀市绦虫病流行区2例已确诊绦虫病患者进行驱虫,剖开孕节子宫,以3 000r/min(离心半径13.5cm)离心15min收集虫卵,用生理盐水调节虫卵浓度为15万个/ml。

　　3． UV致弱六钩蚴制备采用次氯酸钠法孵化六钩蚴,并将六钩蚴收集于培养皿中,置15W(253.7nm)紫外灯下30cm处照射10min,调节六钩蚴浓度为2.5×104万个/ml。

　　4．动物免疫取7头免疫乳猪,沿耳缘静脉注射UV致弱六钩蚴悬液2ml/头,第25d加强免疫1次(1ml/头),每次免疫后第10d采血5ml。第35d处理3头,观察肝脏囊尾蚴寄生情况,收集脾脏,做脾淋巴细胞分离培养,其余4头做虫卵攻击感染试验。

　　5．虫卵攻击感染及实验分组将上述免疫的4头乳猪作为免疫组,未免疫正常乳猪4头作为感染对照组,两组均以灌胃方法感染虫卵15万个/头。于感染第15d和45d分别处理乳猪2头,比较两组肝脏囊尾蚴总数、未成熟囊尾蚴数、成熟囊尾蚴数及退化/钙化的囊尾蚴数,同时计算减虫率。

　　6．乳猪脾细胞分离培养将上述收集的乳猪脾脏用无菌镊子夹碎,制备无菌细胞悬液,移入无菌试管。另取一只无菌试管,先加淋巴细胞分离液,在缓慢将制备的脾细胞悬液加入试管中,分离液和细胞悬液体积比为1︰2,以1 500r/min(离心半径13.5cm)离心20min,吸出单个核细胞层,用PBS洗涤2次,用10%1640细胞培养液重悬,调整细胞浓度至2×106/ml。于96孔培养板中加上述脾细胞悬液100μl/孔,免疫组和正常组各6孔。每组取3孔加终浓度为5μg/ml刀豆蛋白A(Con A),另3孔为对照孔不加刺激物,于37℃、5%CO2培养24h,收集上清,-20℃保存备用。

　　7．血清细胞因子检测以夹心ELISA法测定脾淋巴细胞培养上清INF-γ和IL-4含量,操作步骤按试剂盒说明 书进 行,用Biorad 450酶标检测仪(美国Bio Rad公司生产)测450nm处吸光度(A)值。INF-γ和IL-4试剂盒购自浙大生物基因工程有限公司(美国Rapid BioLab公司产品,分装)。

　　8．血清特异性IgG检测猪血清特异IgG含量以夹心ELISA法检测,操作步骤按试剂盒说明书进行,用Biorad 450酶标检测仪测450nm处吸光度(A)值。猪IgG检测ElISA试剂盒购自上海彩佑实业有限公司。

　　9．统计分析用统计软件Graghpad对观察指标进行t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

　　结果

　　1．乳猪接种UV-致弱六钩蚴后的健康状况3头乳猪沿耳缘静脉接种UV-致弱的六钩蚴后体温未见升高,饮食正常。第35d处理乳猪,肝脏未见囊尾蚴寄生。

　　2．乳猪接种UV-致弱六钩蚴后血清特异性IgG水平乳猪接种UV-致弱六钩蚴第10d和35d,血清特异性IgG含量为(34.4±5.02)mg/ml,与免疫前(13.7±4.37)mg/ml相比差异有统计学意义(t=9.312,P<0.05)。

　　3．乳猪接种UV-致弱的六钩蚴后脾淋巴细胞分泌细胞因子水平变化脾淋巴细胞体外培养24h后,免疫组上清IL-4含量为(39.65±15.3)pg/ml,与正常对照组(15.8±7.5)mg/ml比较差异有统计学意义(F=10.45,P<0.05);经ConA刺激体外培养24h后,免疫组上清IL-4含量为(156.94±11.81)pg/ml,与正常对照组(80.6±13.5)mg/ml比较差异有统计学意义(F=12.82,P<0.05);脾淋巴细胞体外培养24h后,免疫组上清INF-γ含量与正常对照组含量比较差异无统计学意义(F=2.45,P>0.05),经ConA刺激体外培养24h后,两组INF-γ含量均上升,分别为(416.18±24.62)pg/ml和(327.27±79.34)pg/ml,但差异无统计学意义(F=7.17,P>0.05)(图2、3)。

　　4．免疫乳猪虫卵攻击感染后肝脏囊尾蚴回收情况虫卵攻击感染第15d和45d,免疫乳猪肝脏分别收集囊尾蚴178个和13个,未免疫乳猪分别收集305个和106个,免疫乳猪第15d和45d肝脏减虫率分别为41.64%和87.73%。

　　5．免疫乳猪虫卵攻击感染后肝脏囊尾蚴发育情况在攻击感染第15d,免疫乳猪共收集囊尾蚴总数为178个,其中未成熟囊尾蚴数77个,退化或钙化囊尾蚴数101个,未见成熟囊尾蚴;未免疫乳猪退化/钙化囊尾蚴和未成熟囊尾蚴数分别为205个和100个。攻击感染后第45d,免疫乳猪共收集囊尾蚴13个,均为退化或钙化囊尾蚴,未见成熟囊尾蚴,感染对照组未成熟、成熟及退化/钙化囊尾蚴分别为25、38和43个。免疫乳猪囊尾蚴总数远低于感染对照组(P<0.01)。

　　讨论

　　在人体抵抗带绦虫感染中,体液免疫和细胞免疫均发挥着重要作用。吕芳丽等报道,UV致弱日本血吸虫尾蚴可诱导小鼠产生较高水平特异性IgG,接种UV致弱尾蚴小鼠能预防日本血吸虫感染。本实验以紫外线(UV)辐照的方法制备亚洲带绦虫六钩蚴疫苗,沿乳猪耳缘静脉免疫乳猪,结果显示免疫乳猪第35d血清特异性IgG为(34.4±5.02)mg/ml,显著高于免疫前。提示亚洲带绦虫六钩蚴体内含有重要保护性抗原,可诱导乳猪产生较强的体液免疫应答。

　　疫苗诱生的抗感染免疫与Th1/Th2型免疫应答密切有关。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN- γ和TNF-β等细胞因子,促进细胞免疫应答,Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-13,促进体液免疫应答。

　　为了阐明UV致弱亚洲带绦虫六钩蚴疫苗诱导乳猪Th1/Th2型细胞免疫应答情况,本研究通过检测脾淋巴细胞分泌IL-4水平分析诱导的Th2型细胞应答,通过检测INF-γ水平分析诱导的Th1型细胞应答。结果显示,免疫组脾脏淋巴细胞体外培养24h后IL-4含量显著高于正常对照组,经刀豆蛋白A(ConA)刺激体外培养24h后IL-4含量显著高于正常对照组,说明Th2型细胞应答在亚洲带绦虫六钩蚴疫苗诱导乳猪免疫保护中发挥重要作用。脾脏淋巴细胞体外培养24h后INF-γ含量和正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),经ConA刺激体外培养24h后尽管两组IL-4含量均升高,但差异仍无统计学意义(P>0.05),说明Th1型细胞应答在亚洲带绦虫六钩蚴疫苗诱导的免疫保护中处于低应答状态。

　　在虫卵攻击感染试验中多以减虫率和减卵率来评价尾蚴疫苗免疫效果。由于亚洲带绦虫感染中间宿主家猪后,囊尾蚴主要寄生在肝脏,其他脏器尚未发现有囊尾蚴寄生,因此,本研究以肝脏囊尾蚴回收及发育情况来评价UV-致弱六钩蚴疫苗免疫效果。

　　结果显示,在虫卵攻击感染第15d,寄生在免疫乳猪肝脏的囊尾蚴总数为178个,未成熟囊尾蚴数77个,退化或钙化囊尾蚴数101个,未见成熟囊尾蚴,同未免疫组相比,回收的囊尾蚴总数和未成熟囊尾蚴数均减少;在攻击感染第45d,寄生在免疫乳猪肝脏的囊尾蚴总数仅为13个,均为退化或钙化囊尾蚴,未见成熟囊尾蚴。由此可见,接种UV致弱亚洲牛带绦虫六钩蚴疫苗可预防乳猪亚洲带绦虫感染。

　　目前,有关亚洲带绦虫抗感染免疫研究尚处于摸索阶段,本研究仅从UV致弱六钩蚴疫苗免疫乳猪后血清IgG含量变化、Th1/Th2型细胞免疫应答状况及虫卵攻击感染等试验证实六钩蚴体内含有重要保护性抗原,有必要采用蛋白组学和基因工程等技术从亚洲带绦虫六钩蚴体内挖掘有潜力的保护性抗原,并克隆相关基因,这对于预防亚洲带绦虫感染具有重要意义。

　　参考文献：
　　[1] 包怀恩.国亚洲牛带绦虫研究的现状和展望[J].热带医学杂志,2002,2(3):215-99.