调节性B细胞分化和功能研究

　　B 细胞在机体的适应性免疫反应中发挥着重要作用，其主要是通过产生抗体、提呈抗原和产生细胞因子（如 IL-4、IL-6 等）发挥免疫调节作用。但是，机体内也存在着一种数量虽少、但功能独特且能发挥免疫抑制功能的 B 细胞，研究人员将这种 B 细胞称为调节性 B 细胞。在 20 世纪 70 年代中期，研究发现过继输注 B 细胞清除的脾细胞并不能抑制迟发型超敏反应的发生，这提示 B 细胞具有免疫抑制功能。但是，研究人员将 B 细胞的这种抑制功能归因于 B 细胞产生的抑制性抗体，后来通过实验排除了这种可能。1996 年，Wolf 和 Jamewany 等[1]首次阐述了 B 细胞在自身免疫性疾病中的抑制功能。研究人员用髓磷脂碱性蛋白变态性脑炎与完全弗氏佐剂免疫 B 细胞缺陷（μMT）的小鼠构建实验性变态性脑炎疾病模型 （experimental allergic encephalo-myelifis,EAE），EAE 的发展不受控制，而且与野生型小鼠诱导的 EAE 相比，症状不会自发缓解；该研究提示，由于 B 细胞的缺失，不能将 T 细胞转化为保护性的 Th2 型反应，从而导致致脑炎 Th1 细胞向中枢神经系统持续的扩增和迁移；由于 B 细胞缺陷EAE 小鼠不能自发恢复，这提示 B 细胞能抑制自身免疫性疾病。在随后的工作中，研究人员通过不同的实验方法证实，并非所有的 B 细胞都具有免疫抑制功能，只有分泌 IL-10 的 B 细胞具有抑制功能。并且，B 细胞中 IL-10 缺陷的 EAE 小鼠不能自发恢复，同时致脑炎性的 Th1 反应也相应加强[2].这群细胞在炎症最强时增加，且能通过下调与 IL-1 和STAT3 相关的炎症级联反应抑制与 Th2 反应相关的疾病反应[3].在随后的研究中发现，除了 EAE,在其他动物模型，如胶原诱导的关节炎和肠炎中都证实了 B 细胞的免疫抑制功能。2002 年正式将这群具有免疫调节功能的 B 细胞称为调节性 B 细胞。在自身免疫性疾病、肿瘤、移植耐受及抗感染免疫中，调节性 B 细胞都发挥着重要作用。随着研究的逐渐深入，对调节性 B 细胞的认识也不断加深，研究人员发现一些分子与调节性 B 细胞分化和功能密切相关。

　　1 调节性 B 细胞分化和功能相关分子

　　在对调节性 B 细胞的研究过程中发现，Toll 样受体（Toll like receptor,TLR）、CD40、B 细胞活化因子 （B cell activating factor,BAFF）、B 细胞受体（Bcell receptor,BCR）、CD80/CD86 等分子与调节性 B细胞的分化和功能发挥密切相关。

　　1. 1 TLR 与调节性 B 细胞

　　TLR 是一种模式识别受体，对于机体识别外源危险信号，激活天然免疫反应非常重要。TLR 不仅能传递促进炎症反应和自身免疫反应的信号，同时TLR 还能传递一种保护信号[4-5].体外实验发现，用TLR2 和 TLR4 激动剂刺激 MZ-B 细胞能促进 IL-10的分泌，而且，在此过程中如有 CD40 的参与，会进一步促进 IL-10 的释放。以上研究表明，经 TLR 活化的 B 细胞通过表面的 CD40 与 CD4+T 细胞表面CD40L 的作用，促进 IL-10 的产生[6-7].在体外，用脂多糖与美洲商陆、离子霉素刺激能诱导 B 细胞分化产生 IL-10,这种调节性 B 细胞被称为 B10,其表型为 CD1dhiCD5+.当过继输注 CD1dhiCD5+B10 细胞后，能减轻在 CD19 缺陷小鼠体内诱导的超敏反应[8].此外，B 细胞 TLR2、TLR4 及 MyD88 缺陷小鼠会发展成慢性 EAE[9].同样，用 CpG 刺激 B 细胞也能上调 IL-10 的表达[10].已有的研究表明，TLR2、TLR4 和TLR9 参与调控调节性 B 细胞的活化、分化及功能发挥过程。

　　1. 2 CD40 与调节性 B 细胞

　　CD40 是一个膜蛋白，属于肿瘤坏死因子（tumornecrosis factor,TNF）受体超家族的一员。在体内，B细胞表面的 CD40 分子接受 T 细胞表面 CD40L 传递的第二信号后，能分化形成浆细胞分泌抗体。但是，过久或过强的 CD40 信号对抗体的产生有抑制作用。很多研究表明，CD40-CD40L 信号也是调节性B 细胞活化的必要信号。B 细胞 CD40 缺陷小鼠能诱发更严重的 EAE,与此同时，IL-10 的产生也明显减少，而 Th1 和 Th17 反应加强，这提示 CD40 刺激信号对调节性 B 细胞免疫功能的发挥是必需的。进一步的研究显示，CD40 也可作为调节性 B 细胞的一个标志分子。脂多糖刺激能上调 B 细胞 CD40 的表达，而且调节性 B 细胞主要富集在 CD40hiCD5+B细胞中，在 IL-10 缺陷小鼠中 CD40hiCD5+B 细胞比例 较 低 , 这 也 提 示 IL-10 的 自 分 泌 效 应 对CD40hiCD5+调节 B 细胞的形成也是非常重要的[11].最新的研究还表明，肥大细胞可通过 CD40-CD40L介导的信号，扩增能分泌 IL-10 的 B 细胞，但并不直接影响 B 细胞 IL-10 的表达，进而发挥免疫调节功能[12].

　　1. 3 BAFF 与调节性 B 细胞

　　BAFF 属于 TNF 家族的一员，与相应的受体结合促进不同时期 B 细胞的存活和增殖，并参与免疫应答和炎症反应。用 BAFF 刺激后，分泌 IL-10 的 B细胞数目明显增加；当用 TACI-Ig 阻断后，BAFF 诱导的 IL-10 的分泌效应被阻断。BAFF 诱导 IL-10 分泌的 B 细胞表型主要是 CD1dhiCD5+,而且主要是来自于 MZ 的 B 细胞；进一步的研究还表明，BAFF 刺激后，活化转录因子 AP-1 可与 IL-10 的启动子结合从而促进 IL-10 的表达；当用 BAFF 进行体内治疗时，可增加 MZ 区的 IL-10+B 细胞，BAFF 诱导的 MZ区的 IL-10+B 细胞经证实在体内外都有免疫调节功能[13].

　　1. 4 BCR、CD80/CD86 与调节性 B 细胞

　　研究还表明，BCR、CD80/86 分子也参与到调节性 B 细胞的活化与功能发挥过程。CD80-CD86 信号对调节性 B 细胞的作用已在动物自身免疫疾病模型中得到证实。而在接触性超敏反应（contacthypersensitivity reaction,CHS）反应和 EAE 发病开始时，过继性输注抗原起始的 B10 细胞能减轻 CHS炎症及 EAE 的病情，而且体内 B10 细胞调节功能是抗原限制性的，提示需要抗原特异性 BCR 信号。虽然研究发现了多种与调节性 B 细胞的功能和分化相关的分子，但对于调节性 B 细胞的起源、分化仍然存在着很多疑问。

　　2 调节性 B 细胞的起源

　　研究人员在对调节性 B 细胞起源、发育的研究中发现，一些调节性 B 细胞来源于 B1 细胞、MZ-B细胞和一些其他相关的 B 细胞等，因为这类调节性B 细胞经 TLR 介导的信号通路活化后能迅速产生大量的 IL-10,在自身免疫性疾病、炎症和感染发挥免疫调节功能，研究人员将这群细胞称为天然调节性 B 细胞。

　　此外，还有一群细胞被称为适应性调节性 B 细胞，它们要接受 BCR 和 CD40 传递的双信号活化，才能分化成调节性 B 细胞，进而通过分泌 IL-10 来发挥免疫调节功能。已有研究表明，这群调节性 B细胞主要来源于 CD19+CD1dhiCD21hiCD23+T2-MZPB细胞。还有研究人员认为存在一类非成熟调节性 B细胞[13],如小鼠的 T2-MZPB 细胞，人的 CD24hiCD38hiB 细胞[15],在接受 CD40 提供的活化信号后能快速产生大量的 IL-10 来发挥调节功能。

　　3 调节性 B 细胞的作用机制

　　调节性 B 细胞主要通过以下途径来发挥负性调控：一方面直接通过细胞间相互作用发挥负性调节作用，另一方面还通过分泌抑制性细胞因子发挥负性调节作用。

　　3. 1 通过细胞间相互作用发挥调节作用

　　调节性 B 细胞可通过细胞间相互作用调控自身反应性 T 细胞、调节性 T 细胞、巨噬细胞、抗原提呈细胞、自然杀伤细胞等。研究表明，调节性 B 细胞可通过表面分子 B7、CD40 与 T 细胞表面的CD28、CD40L 分子相互作用发挥调控作用。例如，调节性 B 细胞可通过 CD40-CD40L 的相互作用抑制效应性 T 细胞增殖，从而抑制自发性慢性结肠炎。

　　在 EAE 小鼠中，调节性 B 细胞通过作用于调节性 T细胞上的 CD28,使其激活[16];B 细胞可通过表达糖皮质激素诱导的 TNF 受体配体维护调节性 T 细胞数量，从而阻止自身免疫性疾病发生[17].此外，调节性 B 细胞也可能通过 Fas-FasL 介导的信号，引起免疫细胞的凋亡。

　　3. 2 通过分泌抑制性细胞因子发挥调节作用

　　调节性 B 细胞分泌的 IL-10 能够诱导 Th0 细胞向 Th2 细胞发育，诱导 Th2 细胞因子，抑制 Th1 细胞因子，从而抑制 Th1 细胞发育并影响 Th1 /Th2 平衡，因此在 EAE 小鼠中起到保护作用。此外，IL-10可减少细胞表面主要组织相容性复合体类分子的表达和抑制病毒感染患者外周血单核细胞中 TNF-α的分泌，从而抑制免疫反应。 IL-10 还可抑制 Th2型免疫反应性疾病，如小鼠血吸虫病和溃疡性结肠炎，为 Th2 细胞因子 IL-4 引起的疾病。IL-10 还可以抑制树突状细胞产生的 IL-6 和 IL-12,从而抑制Th17 和 Th1 细胞的发育。另外，在慢性炎症环境下，IL-10 还可抑制 IL-1β 的生成及信号转导和转录激活因子 3（signal tranduction and activator of transcri-ption3,STAT3）的活化，直接下调炎性级联反应。此外，调节性 B 细胞还可分泌 TGF-β 发挥负性调节作用。

　　4 调节性 B 细胞与相关疾病的研究

　　近些年，随着对调节性 B 细胞研究的深入，发现临床上一些疾病的发生发展与调节性 B 细胞水平和功能的异常密切相关。临床研究表明，自身免疫性疾病，如多发性硬化（multiple sclerosis,MS）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）和类风湿性关节炎（reheumatoid arthritis,RA）等，以及肾移植耐受、肿瘤免疫、感染免疫中，调节性 B 细胞的水平和功能都受到了一定影响[18],至于调节性B 细胞对于疾病的进程和病情影响的程度尚待更进一步的研究。

　　4. 1 自身免疫性疾病与调节性 B 细胞

　　在正常机体内存在少量的 CD19+CD24hiCD38hiB细胞，能抑制初始 B 细胞分化成 Th1 和 Th2 亚群，并抑制向调节性 T 细胞的转化。在 RA 患者中，CD19+CD24hiCD38hiB 细胞数更少，其功能也与正常人中 CD19+CD24hiCD38hiB 细胞有所不同。虽然能抑制向 CD4+T 细胞向 Th1 的分化，但并不能抑制CD4+T 细胞向 Th17 的分化，以及向调节性 T 细胞的转化。

　　与其他自身免疫性疾病相比，调节性 B 细胞在SLE 患者中的情况要更加复杂。有研究表明，与健康人 B 细胞相比，SLE 患者的 B 细胞释放更多的IL-10.与小鼠模型中的研究情况相似，SLE 患者来源的 CD19+CD24hiCD38hiB 细胞用 CD40 刺激后不能产生 IL-10,也不能抑制 Th1 型反应。进一步对这群细胞中 CD40 信号通路分析发现，延迟的 STAT3 磷酸化可能与 IL-10 分泌能力下降相关。在 SLE 患者中 CD40 信号不能促进 IL-10 的分泌可能是由于持续炎性信号的过度活化导致调节性 B 细胞免疫调节功能的丧失。

　　对毒性弥漫性甲状腺肿（Graves 病）患者的研究发现，外周血中的一些免疫调节细胞水平发生变化，其中调节性 B 细胞的比例明显降低，这提示调节性 B 细胞在 Graves 病的发生发展过程中起着一定作用[19].

　　用 CpG 诱导从克罗恩病患者中分离的 B 细胞，研究发现，与正常人相比，其 IL-10 的产生显着降低；而在动物实验模型中，调节性 B 细胞缺失的小鼠肠炎严重程度显着增加，在过继输注构建的肠炎模型中也产生相似的结果。研究结果还表明，无论调节性 T 细胞存在与否，调节性 B 细胞都能显着降低实验性肠炎，当调节性 B 细胞缺陷或减少时，肠炎加重，这可能提示调节性 B 细胞与克罗恩病的致病机制相关。

　　4. 2 移植耐受与调节性 B 细胞

　　临床对肾移植患者的研究发现，在外周血中CD24hiCD38hiB 细胞 、CD24hiCD27+B 细胞及初始 B细胞都可表达 IL-10 及促炎因子 TNF-α。虽然CD24hiCD38hiB 细胞和 CD24hiCD27+B 细胞分泌 IL-10的能力相同，但 CD24hiCD38hiB 细胞有更高的 IL-10/TNF-α 比例，能更有效地抑制 T 细胞分泌具有促炎作用的 Th1 型细胞因子；当中和 IL-10 的作用后，CD24hiCD38hiB 细胞对 Th1 型细胞因子表达的抑制作用明显受到影响；当阻断 TNF-α 的作用后，则使CD24hiCD27+B 和初始型 B 细胞的抑制能力增强。以上的研究结果提示，IL-10/TNF-α 的比例可能比单独IL-10 的表达水平更有效地提示调节性 B 细胞免疫调节功能。临床肾移植患者中，发生肾移植排斥患者的 CD24hiCD38hiB 细胞的 IL-10 表达水平与耐受移植的患者相似，但 TNF-α 水平较耐受移植的患者升高（IL-10/TNF-a 比例降低）。而且，在体外不能抑制 T 细胞 Th1 型细胞因子的表达，能异常地抑制Th2 型细胞因子的表达。这提示，在肾移植患者中调节性 B 细胞的功能发生了异常改变。进一步的研究揭示，移植患者形成耐受的过程中，B 细胞可能起着重要的作用，尤其是循环中的 T2-B 细胞中可能存在调节 B 细胞，能直接抑制移植物诱发的排斥反应[20].

　　4. 3 肿瘤免疫与调节性 B 细胞

　　临床研究表明调节性 B 细胞与肿瘤的发生发展也密切相关。在肝癌患者中，CD19+IL-10+调节性B 细胞水平降低，而且调节性 B 细胞的水平与乙型肝炎 e 抗原和肝炎病毒 DNA 的拷贝数相关。由于在自身免疫性疾病中，调节性 B 细胞可以抑制自身反应性 T 细胞，因此在肿瘤细胞中也可能通过抑制杀伤性 T 细胞的保护性作用从而使机体的抗肿瘤免疫受到抑制。研究表明，B 细胞表面的 CD40 与肿瘤细胞表面的 CD40L 之间的相互作用诱导 B 细胞 IL-10 的表达。因此，B 细胞分泌的 IL-10 可能是导致CD8+T 细胞和自然杀伤细胞产生 IFN-γ 降低、CD8+记忆 T 细胞减少的原因。

　　研究发现，神经胶质瘤细胞起源的含去整合素和金属蛋白酶域蛋白 10（a disintegrin and metallo-proteinase domain-containing protein 10,ADAM10）能诱导活化的 B 细胞分化成调节性细胞，进而抑制CD8+T 细胞的增殖和调节性 B 细胞来发挥作用[20].

　　此外，研究发现，胶质瘤细胞来源的胎盘生长因子（placenta growth factor,PIGF）能够刺激幼稚 B 细胞分化成调节性 B 细胞，而诱导的调节性 B 细胞能抑制 CD8+T 细胞的增殖、穿孔素和颗粒酶 B 的释放，从而发挥作用[21].在宫颈癌患者外周血中，调节性 B 细胞数目和血清中 IL-10 水平明显升高，且调节性 B 细胞数量随癌细胞浸润程度增强而增加[22].此外，在食管癌患者中发现，临床分期越晚，调节性 B 细胞越多[23],这表明调节性 B 细胞与宫颈癌、食管癌的发生和发展可能存在着一定的关系。

　　4. 4 感染免疫与调节性 B 细胞

　　在 HIV 感染时，由于 IL-10 及其受体、PD-1 及PD-L1 的作用导致细胞毒 T 淋巴细胞（cytotoxiclymphocytes,CTL）活性受损。研究表明，在体外，IL-10hiPD-L1hi的调节性 B 细胞直接减弱了 HIV 特异性的 CD8+T 细胞介导的 CTL 活性。在抗逆转录治疗的 HIV 感染患者中，调节性 B 细胞 IL-10 和PD-1 水平明显升高。当用 IL-10R 和 PD-1 抗体阻断后，能部分逆转调节性 B 细胞介导的对 CD4+T 细胞增殖的抑制作用。研究结果提示，调节性 B 细胞可通过 IL-10 和 PD-L1 的协同作用抑制抗原提呈细胞（antigen presenting cell,APC）功能和 CD4+T 细胞的增殖，从而导致抗 HIV 作用的 CTL 效应减弱，妨碍病毒清除。事实上，在 HIV-1 感染的早期可诱导产生 IL-10+B 细胞，从而有效地抑制机体内抗 HIV-1 T 细胞反应。

　　此外，最近有报道显示在寄生虫感染免疫中，如果氏巴贝虫感染[24],也与调节性 B 细胞密切相关。在巴贝虫感染后的小鼠外周血中 IL-10 水平升高，CD1dhiCD5+调节性 B 细胞比例也显着升高。调节性B 细胞在寄生虫感染过程中具有明显的抗炎作用，其主要机制是通过调节性 B 细胞分泌的 IL-10 将免疫应答从 Th1 型向 Th2 型转化。在慢性肝炎患者中，调节性 B 细胞水平较高，IL-10 水平也显着升高，这可能与机体的抗异性肝炎免疫受损密切相关，从而促进乙型肝炎的进展[25].

　　此外，调节性 B 细胞对于调控病毒感染大脑造成的神经炎症也发挥着重要作用。在动物慢性感染模型中，感染 30 d 后脑部可以检测到较多的CD1dhiCD5+CD19+B 细胞浸润。调节性 B 细胞可以通过调节感染脑部小胶质细胞的反应，促进 CD4+Foxp3+T 细胞的增殖来发挥免疫调节功能[26].

　　5 结语

　　已有的研究表明，调节性 B 细胞在自身免疫病、肿瘤、移植耐受及抗感染免疫方面都可能发挥着重要的作用。因此对调节性 B 细胞的研究有着非常重要的现实意义。尽管研究取得了很大的进展，但是对调节性 B 细胞仍存在着很多疑问。首先，调节性 B 细胞通过 IL-10 来发挥免疫抑制功能，但同时 IL-10 也是一种生长因子，能促进 B 细胞成熟为浆细胞，那么机体如何平衡 IL-10 的双重效应？其次，调节性 B 细胞的活化需要 CD40 提供的信号，但该信号对于 B 细胞的成熟及抗体的产生同样重要，CD40 介导的 B 细胞的这两种不同的分化方向是如何调控的？此外，除 BCR、TLR、CD40 和 CD80/86外，还有没有其他共刺激分子或细胞因子受体涉及到 Bregs 的活化、分化过程？再者，研究还未发现调节性 B 的特异转录因子。尽管人们对调节性 B 细胞的认识越来越深，但仍有许多疑问需要在今后进行深入研究。

　　【参 考 文 献】

　　[1] Wolf SD,Dittel BN,Hardardottir F,et al. Experimentalautoimmune encephalomyelitis induction in genetically B cell-deficient mice[J]. Exp Med,1996,84（6）：2271-2278

　　[2] Fillatreau S,Sweenie CH,McGeachy MJ,et al. B Cells regu-late autoimmunity by provision of IL-10 [J]. Nat Immunol,2002,3（10）：944-950.

　　[3] Mizoguchi A,Mizoguchi E,Takedatsu H,et al. Chronic intestinal inflammatory condition generates IL-10-producing regu-latory B cell subset characterized by CD1d upregulation[J].Immunity,2002,16（2）：219-230.

　　[4] Medzhitov R,Preston-Hurlburt P,Janeway CA Jr. A humanhomologue of the Drosophila Toll protein signals activation ofadaptive immunity[J]. Nature,1997,388（6634）：394-397.