生物钟的作用机制及其与衰老退行性变的关系(2)

　　真核细胞的细胞分裂周期是一个复杂的级联事件，以细胞复制为顶点[28].从一种调节状态到另一种开始的这些转变，是它们自身的反馈控制，决定细胞物理状态的底物修饰。由遗传和生化分析阐述的基本机制，已经在以下生物体中保守，如酵母菌、非洲爪蟾蜍、蛤蚌、海星受精卵、培养的人类细胞和高等植物[29].

　　两个重要转变控制点存在细胞分裂周期 G1/ S 和 G2/ M边界。M 期被描述为激酶的激活（ MPF,成熟促进因子，当注入爪蟾卵细胞时，以诱导细胞分裂的能力命名） ,其中包含两个组件子单元。一个是 p34cdc2蛋白（ S. 非洲粟酒基因 cdc2 或同族体的产物，S. 啤酒的 CDC28） ,其能使体内的酪蛋白及组蛋白 H1 磷酸化和在有丝分裂有最大的激酶活性。另一个是细胞周期蛋白，其浓度在细胞分裂周期之间波动。它在细胞间期逐步地累积，形成 p34cdc2复合体和激活蛋白激酶； 在有丝分裂中降解，灭活激酶和 MPF 的活性。因此，细胞周期蛋白 -cdc2 / CDC28 （ MPF） 系统就像一个振荡器或者"生物钟",在有丝分裂时重设到细胞间期和其似乎组成一个通用的细胞分裂循环的"引擎"[29].现在我们知道细胞周期蛋白的整个家族，p34cdc2周期性地把调节细胞分裂周期进程的蛋白激酶活性联系起来造成连续波动，在植物和动物的细胞分裂周期中，cdc2 关联基因的确切种类得到不同表达。

　　2. 1 环腺苷酸（ cAMP） 的作用 众所周知，cAMP 在细胞的调节中起着关键作用[30],可影响昼夜振荡器和p34cdc2---细胞周期蛋白通路之间的耦合，（ 可能和其他参与者一致） 参与细胞分裂周期活动的阀门效应器到昼夜周期的特定相位。

　　甚至，cAMP 似乎有能力控制细胞分裂周期进程中某些限速步骤，刺激一些细胞的增值，但在其他细胞，却有相反的效果，或一点效果都没有[31,32].在很多细胞类型中，cAMP的短暂增加与 G1/ S 和 G2/ M 边界的细胞周期转变有关。酵母菌的遗传试验和哺乳动物的药学研究[30,33]已经显示，cAMP 水平的一过性升高和接着下降，对于 DNA 的合成和MPF 的诱导酪氨酸-脱磷酸作用激活的启动是有必要的[34],第二次 cAMP 剧增与完成相关，从有丝分裂中退出[35].细胞分裂周期不同相位中，cAMP 浓度的相似变化已在裸藻中出现[36].这些信号分别与 p34cdc2- p60 （ G1细胞周期蛋白） 蛋白激酶复合物和 p34cdc2- 细胞周期蛋白 B （ 有丝分裂细胞周期蛋白） 蛋白激酶复合物功能相一致。

　　因此，在动物和酵母菌中，cAMP 浓度波动代表细胞分裂周期进程，信号转导的重要环节。在真核细胞里，AC 信号通路的转录调节下刺激受 cAMP-响应核因子家族调整。这些因子包含基本的结构域/亮氨酸拉链模序和 cAMP-反应元件（ CRE） 二聚体。CRE-结合蛋白（ CREB） 的功能由 cAMP 依赖性蛋白激酶的磷酸化作用调整。

　　2. 2 环腺苷酸（ cAMP） 对细胞分裂节律的干扰 如果周期性的信号在裸藻细胞分裂节律的产生中起作用，通过昼夜振荡器，干扰或覆盖 cAMP 水平的控制这一条件应该在下游活动中引起扰乱[18].用了这种药（ 图 6A） ,依靠细胞分裂周期的相位，引起细胞分裂周期的缩短或加长，通过外源性cAMP,其振荡的干扰导致了来自昼夜定时器细胞分裂周期的暂时解耦合。当在 CT16 和 CT22 之间给予 cAMP 时，能观察到前进； 当在 CT03 和 CT09 之间给予 cAMP 时，能获得下一个同步分裂步骤（ 相当于 9 小时） 的延迟。在 CT06-08 和 CT18-20 时获得最大效应，相当于内源性 cAMP 水平是最低的时间。在昼夜时间已经获得细胞分裂周期的最大 + ΔΦs 或者- ΔΦs,也可得到计量反应曲线。仅仅 1 nM cAMP 足以干扰细胞分裂周期运输。与细胞分裂周期的细胞周期蛋白生物钟相比，不像可兴奋组织，其 cAMP 的确能相位漂移信号输出节律[37,38],昼夜振荡器不用通过添加 cAMP 来重置： 分裂节律回到原始位相（ 图 6B） .

　　随着 cAMP 的注入，在生长曲线中观察到的细胞分裂步骤 ΔΦ ,反映细胞分裂周期进程速率的真实变化。通过流式细胞术测量细胞 DNA 含量提示[18],在 CT06 - 08 注入 cAMP延迟穿过 S 期，可能穿过 M 期（ 图 7A） .若在 CT18 - 20 增加，cAMP 加速 G2/ M 过渡（ 图 7B） .细胞分裂节律的这些效应只是短暂的： 48h 后，和未干扰的控制一样，分裂出现在相同的相位（ 图 6B） .

　　通过检测减小 cAMP 振荡振幅的药物效应，或者保持cAMP 在某一水平，这样所有 cAMP 的受体就能永久饱和，证明在细胞分裂周期进程中 cAMP 水平的内源性昼夜节律变化有足够的振幅产生类似的效应： 我们希望这种药用来阻止分裂节律性的表达。甚至 AC 的激活剂，cAMP 类似物毛喉素使cAMP 维持在异常的高水平[21],连续黑暗里，增加不同步 ZC突变株细胞，出现细胞群的快速失调和最终失去分裂节律性[18].

　　这些发现指出，尽管裸藻中 cAMP 信号不重置昼夜振荡器（ 因此 cAMP 不大可能代表生物钟的"齿轮"） ,但它们的确调节细胞分裂周期进程，从振荡器作用下游---正如 Zatz[39]所提出的小鸡松果体细胞，可能存在并行通路。

　　2. 3 下游通路： 环腺苷酸（ cAMP） 依赖性蛋白激酶 在振荡的 cAMP 系统和细胞分裂周期之间，什么是连接环？ 根据应用时 CT 的通路，无论什么是细胞周期受到影响的调节通路，它必须能解释相同信号是如何干扰不同的通路。一种可能性，是 cAMP 通过不同的"受体"表现为有选择性地调整两个调节通路中的一个或另一个。

　　我们已经证明，裸藻 ZC 突变株包含 cAMP 依赖性蛋白激酶（ cPKA 和 cPKB） 两个类型，对于 cAMP 和几个 cAMP 类似物来说，它们有不同的密切关系[40].发现细胞提取物包含两个 cAMP-结合蛋白，一个与 cAMP 有很高的亲和力（ （ Kd 值为10nM 和 19nM） ,一个能通过 DEAE-纤维素色谱分析法分离。

　　用肯普肽（ 激酶底物肽） 作为底物（ 从哺乳动物细胞中，由cAMP 依赖性激酶特异性磷酸化） 分析蛋白激酶。用 DEAE-纤维素色谱分析法部分提纯 cAMP 后可观察到激酶活性的刺激。分辨两个活性的峰值相当于两个不同的 cAMP 类似物特异性酶。因此，cAMP 依赖性激酶类似于动物细胞，通过靶蛋白的磷酸化，植物细胞中的 cAMP 信息传递可继续进行。

　　在细胞分裂周期进程的控制中，通过 cAMP 类似物提供工具给它们各自作用的研究，抽出裸藻中识别的两个激酶的差异激活。我们断定，cAMP 或 cAMP 类似物的最小剂量可引起在人工白天或黑夜中分裂节律的 ΔΦs[18].在 CT06 -08和 CT18 -20 获得的不同结果提示，由两个不同的 cAMP 激酶来介导不同 CTs 时 cAMP 的效应。因此，选择性激活 cPKA的 8-苄氨基嘌呤-cAMP（ 8-BZA-cAMP） 在 CT06 -08 增加时，诱导-ΔΦs,但在 CT18 - 20 时没有效应。相反地，特异激活cPKB 的 8-（ 4-硫代氯苯基） -cAMP（ 8-CPT-cAMP） 在 CT18 - 20增加时，诱导 + ΔΦs 和分裂节律性的减少，但在 CT06 -08 增加时，不干扰分裂节律。

　　cAMP,8-BZA-cAMP,8-CPT cAMP 与 6-MBT-cAMP 的剂量之间也有关联，引起在 CT06 -08 时细胞分裂周期和 cPKA类似物 Ka值的干扰，结果提示 cPKA 在这些 CTs 时，介导cAMP 的延迟效应。同样地，相同核苷酸的剂量之间也有关联，引起在 CT18 - 20 时细胞分裂周期和 cPKB 类似物 Ka值的干扰，结果表明在 CT18 - 20 时 cPKB 介导 cAMP 的加速效应。这些发现简单的解释是这些激酶是在细胞分裂周期不同阶段表达，在哺乳动物细胞中，被描述为Ⅰ型和Ⅱ型 cAMP 依赖性激酶。

　　3. 小结

　　藻类比如纤细裸藻已经作为试验模型，被用来了解昼夜节律记时的作用机制，已经超过了半个世纪，是因为它们方便利用，易于测量其生理特征以反映昼夜节律的输出信号。另外，藻类的代谢轮廓分析日益重要，因为它们能提供丰富多样的化合物，对于食品、医药产业、生物燃料和公共卫生等方面具有很大潜在的经济价值[41].生物钟使裸藻能维持近似1 小时的昼夜节律，其主要通过接受光信号，经过一系列的信号转导途径，在昼夜振荡器中不断地产生振荡，最后通过输出途径控制基因的节律性表达等； 但仍存在局限性： 高通量组学筛查经常遇到的问题是只能鉴别基因和蛋白，而不能知道其功能。

　　很多的功能分析会降低相关信息量，比如在昼夜时间的系列研究中，由于不完善的注释而很少使用。通过对裸藻昼夜节律深入的研究，对揭示生物钟的本质、生物进化的分子机制等具有重要意义，可为各种动植物包括人类的生产实践与医疗保健等方面提供可靠的理论依据。