脊髓损伤运用电针结合减重步行训练疗法的治疗机制

　　脊髓损伤发生率随着汽车产业的迅猛发展呈现逐年增高的趋势，而脊髓一旦损伤往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍，给患者、家属、社会带来了极大的负担。脊髓损伤与中枢神经具有密切关系。据报道，抑制因子的存在以及促进性环境的缺失是阻碍中枢神经再生的众多因素之一。并发现髓磷脂相关抑制因子 Nogo、MAG、OMgp（ Oligdendro-cyte - associated myelin glycoprotein） 具有激活 Rho /Rock 激酶信号通路的作用。有研究发现电针作用于脊髓损伤后的大鼠能抑制这些因子表达，而运用Rho 抑制剂如盐酸法舒地尔可以通过竞争性拮抗作用抑制该通路[1],从而促进轴突再生[2 -3].课题组的前期研究已证实夹脊电针对脊髓损伤后的大鼠在行为学以及与神经再生功能相关的蛋白表达中具有良性干预作用[4 -5].本研究欲从 Rho/ROCK 激酶信号通路入手，观察电针结合运动疗法对该通路上的 Cdc42 的蛋白表达影响。

　　1 材料与方法。

　　1. 1 实验动物与分组 健康成年雄性 SD 大鼠 90只，购于中国科学院上海实验动物中心，体重 180 ~200g.实验前适应性饲养一周，采用 SPSS 软件产生随机数字给予染色标记编号，将其随机分为假手术对照组（ A 组） ,造模后再将其余大鼠随机分组为模型对照组（ B 组） 、夹脊电针观察组（ C 组） 和夹脊电针结合 BWSTT 观察组（ D 组） 、药物组（ E 组） .每组在 7d、14d、28d 三个时间点各取 6 只。

　　1. 2 实验主要试剂与仪器 Cdc42 一抗（ abcam,1∶ 1000） ; SP - 9001 免疫组化试剂盒（ 博海生物工程有限公司） ; DAB 显色试剂盒（ 中杉金桥） ; 盐酸法舒地尔（ 天津红日药业股份有限公司） ; 佗牌 0. 5 寸无菌针灸针（ 0. 30mm × 13mm） ; 韩氏（ HANS） 电针仪（ HANS -100） ; NYU 脊椎冲击损伤仪（ 美国，NYU -2） .

　　1. 3 脊髓损伤模型的制备 腹腔注射 10% 水合氯醛（ 3. 5mL/kg） 进行麻醉，背部暴露 T9 - T10 段脊髓，运用 NYU 脊椎冲击损伤仪以5cm/10g 的势能撞击暴露段脊髓，造成该区域急性中度脊髓损伤，然后冲洗伤口后逐层缝合。假手术对照组仅切除椎板。三个征象出现其中两个即为造模成功： ①身体痉挛性颤动； ②尾巴痉挛性摇动； ③硬脊膜内充血或血肿。术后腹腔注射青霉素抗感染，按摩膀胱帮助排尿。各组大鼠造模后分别进行 BBB 评分，2 分以上剔除并进行动物实验的增补。术后分别在 7d、14d、28d 各时间点记录 BBB 评分以观察运动功能恢复状况后处死取损伤节段脊髓进行检测。

　　1. 4 治疗方法 模型对照组： 给予腹腔注射生理盐水（ 量同药物组注射的药物） ,每日一次； 电针组： 于造模成功后给予夹脊电针治疗。在损伤椎体的棘突旁开距后正中线 3 ~ 4mm 处取穴，垂直进针约 3 ~4mm,针尖触及椎板，将 HANS - 100 的导线正负极夹在同侧的毫针针柄上，频率 2/100Hz[6],电流1mA,20min / 日； 电针结合运动组： 在夹脊电针治疗的基础上，术后第七天时进行减重步行法康复训练。训练装置以大鼠跑步机为运动平板，然后将一根带夹子的短铁丝夹住大鼠的项背部皮肤，再用一根带夹子的可调节长度的铜线夹住大鼠背侧靠近尾部的皮肤，训练平板的速度为 8m/min,减重量为大鼠体重的 70%、60%、30%,分别维持一星期。训练时间为每日 2 次，每次 5min.

　　1. 5 检测方法。

　　1. 5. 1 Western blot 检测 取出标本，提取蛋白，制作标准曲线，测定标本的蛋白浓度，以总蛋白量为30ug 计算上样体积。一抗浓度（ Cdc42 1 ∶ 1000,内参 β - actin 1∶ 1000） ,4℃孵育过夜，二抗以 1: 5000溶于 T - TBS,室温孵育 1h.暗盒中放上 X - rayfiLm 曝光 5 ~ 10min 后进行显影和定影，采用 ImageJ软件分析蛋白相对表达量（ 蛋白相对表达量 = 蛋白表达量/内参 β - actin 表达量） .