脊髓损伤运用电针结合减重步行训练疗法的治疗机制(2)

　　1. 5. 2 免疫组化检测 样本通过多聚甲醛固定后保存于 -80℃冰箱，OCT 制作冻头，切片厚度为 14微米，贴片法，每张片 5 个样本，切五取一。37℃ 复温后 PBS 洗去 OCT,3%双氧水浸泡15min,封闭1h,一抗 4℃ 孵育过夜，浓度（ Cdc42 1∶ 1000） .二抗37℃ 孵育 1h,辣根过氧化物酶浸泡 15min,DAB 试剂盒显色，苏木素复染，脱水后封片。光镜下观察阳性细胞。

　　1. 6 统计学处理 实验所得数据均用 SPSS17. 0 统计软件包进行处理，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较若方差齐时采用 LSD - t 检验，若方差不齐采用 Dunnett's - t 检验。最终结果以 x珋 ± s 来表示，P <0. 05 表示数据具有显着性差异。

　　2 结果。

　　2. 1 免疫印迹法 结果所示，Cdc42 各个时间点的表达量在假手术组中保持在较低水平，在模型组中表达增多。电针组、药物组、电针结合运动组在 7、14、28d 时 Cdc42 的表达均比模型组有不同程度的增加，差异均具有显着性。在电针结合运动组中，Cdc42 的表达量在 28d 有明显升高，与电针组相比具有显着性差异，差异具有统计学意义（ P <0. 05） .（ 见表 1、图 1）2. 2 免疫组化结果 如表 2 所示，Cdc42 阳性细胞计数在假手术对照组的 3 个时间点均处于低水平，SCI 后阳性计数明显增高，且随着时间出现逐渐增加的趋势，说明神经损伤具有一定的自愈性。观察组与模型组相比在 3 个时间点均有差异，差异有统计学意义（ P <0. 05） .电针结合运动组与单纯电针组相比仅在 7d 时差异不明显，其余两个时间点的差异均具有统计学意义（ P <0. 05） .电针结合运动组与药物组相比，仅在 7d 时差异较明显，有统计学意义（ P <0. 05） ,在 14d 和 28d 时，药物组虽然计数较电针结合运动组多，但是差异不大，且差距随着时间减少。因此从长期的康复来说，电针结合运动该治疗方案甚至会优于药物治疗。

　　3 讨论。

　　3. 1 Rho / ROCK 激酶信号通路 Rho / ROCK 是组织中普遍存在的一条参与细胞的收缩、黏附、迁移、增殖、细胞骨架的形成等生理功能的信号通路[7 -8],其关键分子包括 Rho GTP 酶，Rho 激酶（ Rho associ-ated kinase ROCK） 及其作用底物。髓鞘相关抑制因子（ Nogo、MAG、OMgp 等） 激活 Rho 蛋白，从而启动该信号通路。Rho/ROCK 被激活后，影响肌动肌球蛋白的聚合而阻碍轴突再生[9 -10].因此抑制 Rho/ROCk 的信号传导通路可能成为促进轴突再生的一种途径。

　　3. 2 Cdc42 细胞分裂周期蛋白（ cell division cycle）Cdc42 是 Rho GTPase 蛋白家族的成员之一[11].该家族蛋白具有重组细胞骨架、调控基因转录和转导细胞信号等生理功能[12 -13].Luo 等[14 -15]在果蝇以及神经母细胞系上进行实验中证实 Cdc42 具有促进神经细胞迁移及轴突树突的生长作用。研究表明RhoA 和 RacL、Cdc42 在树突棘延伸上存在着相互拮抗的作用，RhoA 可以抑制树突棘的延伸和生长，而 RacL、Cdc42 促进树突棘的生长和延伸，而在Rho / ROCK 激酶信号通路激活途径中，RhoA 与激活该通路存在正相关[16].因此，Cdc42 可能具有抑制该信号通路，从而起到促进轴突再生的作用。本课题组也证实单纯夹脊电针以及电针结合运动疗法能够促进 Cdc42 的蛋白表达，这可能与该治疗方法作用于此通路相关。

　　3. 3 减重步行训练 （ body weight support treadmilltraining,BWSTT ） 减重步行训练是由 Barbeau等[17]于 1987 年在前人的理论基础上设计的运用于截瘫患者康复治疗的训练方法。它由一个速度可控的电动跑台以及上方可以对患者进行减重的轮滑吊带组成。这一装置不断改良，有学者通过实验证实在超微环境下，BWSTT 能够促进神经再生修复[18].

　　BWSTT 主要针对颅脑损伤、脊髓损伤等引起的下肢运动功能异常的患者，现已广泛应用于临床康复治疗。李华等[14]将 42 例不完全脊髓损伤患者随机分为 BWSTT 组与对照组，患者均接受常规截瘫康复治疗，BWSTT 组在此基础上，每日加减重步行训练 1 次，治疗 1 个月后，患者的步长、步速和功能性步行分级较治疗前有明显改善，且与对照组之间相比具有显着性差异。李惠兰等[15]通过动物实验研究发现督脉电针与减重步行训练在促进横断性脊髓损伤大鼠的运动功能恢复以及 NGF、GAP -43 的蛋白表达中效果显着，且督脉电针优于 BWSTT.

　　以上学者从不同的角度证明减重步行训练对于脊髓损伤（ 包括横断性以及不完全） 的后期康复意义深重，而本课题组通过实验得出脊髓损伤大鼠在电针与减重步行训练相结合的治疗作用下，效果更是优于单纯电针，这一发现为脊髓损伤患者的临床康复治疗提供了新的思路。

　　参考文献。

　　[1]Ito T,Ohtori S,Hata K,et al. Rho kinase inhibitor improves motordysfunction and Rho - associated coiled - coil forming protein serine /threonine kinase in mice[J]. FEBS Lett,1996,392 （ 2 ） : 189 -193.

　　[2]李振鹏，孔抗美，陈育春，等。 电针治疗对大鼠脊髓损伤后 Nogo- A 蛋白表达的影响[J]. 汕头大学医学院学报，2008,21 （ 3 ） :129 - 137.

　　[3]汪吉明，孔抗美，崔华中，等。 电针对脊髓损伤后神经生长相关蛋白 GAP -43 表达的影响[J]. 广东医学，2007,28（ 1） : 40 -41.

　　[4]马睿杰，张柳娟，孙连珠，等。 夹脊电针干预脊髓损伤大鼠 OMgp表达的研究[J]. 中华中医药学刊，2014.32（ 6） : 1 283 -1 285.