萜类化合物的合成生物学研究与展望(3)

　　生物合成法又分为两种，一种是通过代谢工程手段直接在植物中促进萜类的合成 ;另一种是通过合成生物学在微生物等底盘细胞中合成目标产物。第一种方法是直接向植物中引入强启动子驱动的萜类合酶，从而实现萜类的生产[41].如通过过表达芳樟醇合酶可以大量生产单萜芳樟醇，构建的转基因植株包括矮牵牛、番茄、康乃馨、马铃薯及拟南芥[42-45].这种代谢工程操作不仅用于高效生产萜类化合物，还可以用于改变作物的一些性状，如提高观赏植物和水果等的香味和口感，改善植物的授粉效率，增强植物的抗病和抗虫能力等。此外，还能帮助理解植物萜类化合物的合成途径和调控方式，揭示已有途径的旁支通路和反馈途径等。但是，由于植物生长缓慢，且体内代谢过程错综复杂，这种萜类合成方法面临着目标产物产量有限、后期分离困难、生产周期长等问题。为了实现萜类的高产，研究人员越来越多的开始尝试合成生物学手段[46].
　　
　　1.3  萜类的合成生物学研究
　　
　　1.3.1萜类合成生物学的设计策略
　　
　　1.3.1.1底盘细胞的选择及改造选取不同的底盘细胞对于萜类的生物合成有关键性的影响。例如，大肠杆菌中萜类前体 IPP 和 DMAPP 主要用于 t RNA的异戊烯化和 FPP 的合成，进而用于醌类和细胞壁的合成，因此该底盘细胞主要用于酮、醇、酸等化学品而非萜类的生物合成[47].代谢工程和合成生物学领域的先驱人物，如加州大学洛杉矶分校的 JamesLiao 教授和伯克利分校的 JayKeasling 教授，他们的实验室也曾通过大肠杆菌进行萜类化合物的生物合成，但均需重构 IPP 和 DMAPP 的合成途径。如Farmer 等[48]在大肠杆菌中重构 MEV 途径，提高了番茄红素的生物合成产量 :向培养基中外源添加丙酮酸，并在重构番茄红素合成途径的大肠杆菌中过表达磷酸烯醇式丙酮酸合酶（phosphoenolpyruvatesynthase,PPS），使得丙酮酸转化成磷酸烯醇式丙酮酸，促进碳代谢流由丙酮酸向 G-3-P 逆流，进而得到大量类异戊二烯的前体，最终每克细胞干重中得到了 25mg 番茄红素，比单纯重构番茄红素合成途径的大肠杆菌的发酵产量提高了 5 倍。Kim 等[49]在重构番茄红素合成途径的大肠杆菌中，使用CRISPRi 技术重新平衡 MEV 途径的代谢流，通过设计不同的 sg RNA 并比较其基因敲除效率，将 MVA途径中的基因表达平均降低了 81.6:,最终使得番茄红素的产量提高了 9 倍。Martin[25]则通过在大肠杆菌中建立酵母 MEV 途径促进 FPP 的合成，同时过表达紫穗槐二烯合酶，并向培养基中外源添加甘油（0.8:V/V），最终使得青蒿素前体紫穗槐二烯的积累高达 112.2mg/L.
　　
　　由于细菌缺少翻译后修饰而难以表达细胞色素P450,且很多萜类化合物具有抗菌活性，因此多采用酿酒酵母等真核生物进行萜类的生物合成[50,51].利用酵母细胞工厂的好处是酵母能够直接合成较多的 DMAPP 和 IPP,从而为萜类合成提供大量前体物。选用酵母作为底盘细胞还可以通过酵母基因组的必需基因分析，保留最小基因组，从而在萜类的生物合成过程中减少其内源消耗。所有基因工程操作都可以通过染色体融合完成，保证了酵母工程菌株的遗传稳定性。通过酵母全基因组的筛选还能够获得一些高活性的内源启动子与终止子，如清华大学戴俊彪课题组[52]通过筛选酿酒酵母全基因组，获得了一些酵母来源的启动子和终止子。此外，他们还在酿酒酵母中构建了生物合成的功能模块，能够快速实现多基因代谢通路中的蛋白的异源表达，并完成多个转录单元的一步组装。选择酵母细胞的另一个优势是可以通过对酵母细胞进行耐高温、耐酸、耐盐等抗逆改造，如清华大学林章凛教授[53]主持的“973 项目”研究了适合微生物的合成生物学抗逆元器件，获得了具有重要产业价值的微生物抗酸器件和工业菌株，为实现萜类目的产物的高密度发酵和产业转化奠定了研究基础。
　　
　　1.3.1.2萜类合成途径的挖掘合成途径的挖掘是合成生物学快速发展的保障。目前已经从拟南芥、水稻、苜蓿、百脉根等不同的植物中分离得到了几十个编码鲨烯环化酶的基因[54].大量的基因组学数据表明，细胞色素 P450 家族在植物萜类化合物的合成过程中扮演着关键的角色[55].随着全基因组测序、第二代 DNA 测序技术以及宏基因组学技术的发展，越来越多的天然产物的代谢途径被挖掘出来。研究发现，植物萜类化合物的合成往往伴随着基因表达簇结构的发现。通过萜类化合物基因表达簇的鉴定，研究人员发现了不同萜类合成通路中的鲨烯环化酶、共表达的 CYP450以及辅酶 CPR.如中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄三文团队[56]通过破解黄瓜的基因组数据，发现黄瓜苦味基因（Bitter,Bi）基因编码的蛋白为鲨烯环化酶。为了破解黄瓜苦味合成、调控及驯化的分子机制，他们进一步挖掘黄瓜组学数据，并结合代谢组学、遗传学以及分子生物学技术，最终鉴定出 9 个与黄瓜中葫芦素 C 合成相关的基 因（Csa6G088690、Csa6G088160、Csa6G088170、Csa6G088710、Csa3G698490、Csa3G903540、Csa3G903550、Csa1G044890、Csa6G088700）[19].这一系列研究为三萜葫芦素的生物合成奠定了重要的数据基础。
　　
　　萜类的生物合成是一个多因素调节的动态过程。通过异源基因的密码子优化、启动子终止子的选取和搭配组合、代谢途径基因簇的共表达、合成途径的标准化组装、关键调控基因的精细调控、细胞合成工厂的创建、发酵条件摸索及发酵工艺优化等方面的深入研究，能够显着提高萜类合成关键酶的异源高效表达以及萜类的合成能力。
　　
　　1.3.2萜类化合物的合成生物学研究进展
　　
　　1.3.2.1单萜酿酒酵母能够利用体内的MEV 途径合成 IPP 和 DMAPP,进而缩合成 GPP,为单萜的生物合成提供前体物质。因此，在酿酒酵母中外源表达单萜合酶有望实现单萜的合成。以芳樟醇为例，Herrero 等[57]通过在酿酒酵母 T73-4 中表达来源于仙女扇的 S-芳樟醇合酶（linaloolsynthases,LIS）的基因，从而引入了芳樟醇合成代谢通路，构建出了能够有效分泌芳樟醇的重组菌株，最终达到 18μg/L的积累水平。类似地，Zhang 等[58]在酿酒酵母中表达了来源于软枣猕猴桃（Actinidiaarguta）的芳樟醇合酶的基因，实现了芳樟醇的产量为 59.85μg/L.Rico 等[59]在表达芳樟醇合酶的基础上进一步调节了该菌株中的类异戊二烯生物合成途径，通过过表达羟甲基戊二酸单酰辅酶 A 还原酶（3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzymeAreductase,HMG-Co A 还 原酶）的催化结构域（truncatedHMG-Co Areductase,t HMGR），解除了 MEV 途径中羟甲戊酸合成的内源限速步骤，最终使得芳樟醇产量进一步提高到132.66μg/L.考虑到异戊二烯二磷酸异构酶（IDI1）参与的异构化反应能够实现 IPP 和 DMAPP 之间的可逆转化，是实现 GPP 合成的重要步骤，江南大学陈坚课题组[60]在过表达HMG1的催化结构域的基础上，同时过表达了 IDI1,以期提高酿酒酵母中 MEV 合成途径的代谢通量，强化 GPP 合成供给，结果发现芳樟醇产量仍然只有 127.71μg/L.为了提高单萜在酿酒酵母中的合成，陈坚课题组[61,62]进行了大量的深入研究，结果发现柠檬烯处理酿酒酵母细胞会诱发活性氧胁迫，引起菌体凋亡。Parveen 等[63]则通过转录组学分析发现，单萜α单蒎烯（α-terpinene）胁迫会造成酿酒酵母的细胞膜功能损伤。因此，宿主对单萜的低耐受程度可能是限制单萜产量提高的瓶颈。对于酿酒酵母耐受单萜的机理研究将为构建高单萜耐受性的酵母菌株提供更多的理论依据。