萜类化合物的合成生物学研究与展望(4),生物化学论文

　　1.3.2.2倍半萜青蒿素是具有内过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物，是目前研究最多关注度最高的一种倍半萜。以有效剂量的青蒿素为基础、辅以传统抗疟药物的联合疗法（artemisinin-basedcombinationtherapy,ACT）被世界卫生组织批准为治疗疟疾的最有效的办法。由于人工合成青蒿素的难度很大，且价格昂贵，青蒿素的生产曾主要依赖从中国传统中草药青蒿中提取，但这种方法产量极低，导致青蒿素类药物紧缺，价格波动幅度大，ACT 疗法昂贵，因此亟需寻找更稳定的青蒿素生产方法。Keasling 团队[64]对于青蒿素生物合成的研究工作是合成生物学领域取得的一项突破性进展。截止目前，他们已经在酿酒酵母中实现了青蒿素前体青蒿酸的合成与产业化，为化学合成青蒿素以及活性抗疟药物青蒿琥酯（artesunate）提供了大量前体。在该项工作中，他们首先在酵母中过表达了来自青蒿的紫穗槐-4,11-二烯合酶，实现了 FPP 向青蒿素前体紫穗槐二烯的合成，但合成量很低，这是因为酵母细胞中的大部分 IPP 和 DMAPP 前体会进入麦角固醇合成通路。随后，他们在该菌株中重构了MEV 途径，使得与 FPP 合成相关的基因发生上调，而 FPP 流向其他通路如固醇的基因表达则发生下调，从而提高了 FPP 的合成产量，并通过染色体重组将MEV 途径整合到酵母基因组上，保证了改造菌株的遗传稳定性，再辅助以固醇转录因子 UPC2 的表达，最终使得紫穗槐二烯的合成产量提高到 153mg/L,比之前的报道高出了 500 倍。后续的发酵实验甚至使得紫穗槐二烯的产量达到 27g/L.由于很多萜类代谢的中间产物如 FPP 对细胞均有毒性，研究者希望通过在大肠杆菌中构建压力传感器，调节细胞的代谢负荷，进而提高目的产物的表达。Keasling 实验室的成员通过全基因组的转录芯片测序，鉴定出了一些能够响应有毒代谢产物的启动子。采用响应FPP 积累的启动子驱动大肠杆菌中紫穗槐二烯合成途径的基因表达，结果使得紫穗槐二烯的产量达到1.6g/L.因此，根据目的产物的合成途径，选取对某个中间产物敏感的启动子驱动目的产物的基因表达，可以有效提高目的产物的产出。这一方法将是提高目的产物的一种重要的通用工具[65].为了实现紫穗槐二烯向青蒿酸的转变，他们从青蒿中分离得到了一种 CYP450 单加氧酶 CYP71AV1,并协同表达 CYP71AV1 的辅酶 CPR,实现了紫穗槐二烯的三步氧化，最终使得 1L 发酵罐中青蒿酸产物的产量达到 115mg/L,生产效率比植物提取法提高了两个数量级。为了进一步提高青蒿酸的合成，Keasling团队在酵母中将 MEV 途径中的所有的酶全部进行了过表达，青蒿酸的产量达到约 1.6g/L,而紫穗槐二烯的产量更是比青蒿酸高 10 倍以上。于是，他们进一步对紫穗槐二烯生产菌株的发酵条件进行了优化，最终使得紫穗槐二烯的产量高达 >40g/L,为青蒿素的化学合成提供了大量前体[66].在此基础上，他们团队在青蒿中鉴定出了两个新的植物脱氢酶（artemisnicalcoholdehydrogenase,ADH1 ;artemisnicaldehydedehydrogenase,ALDH1）和一个细胞色素氧化酶（cytochromeb5,CYB5），通过在酵母中进行表达，让紫穗槐二烯到青蒿酸的合成过程变得更具体高效，最终使得青蒿酸的发酵产量达到了 25g/L[67].这项技术的知识产权已经免费释放。Keasling 团队的这一系列工作极大地推动了青蒿琥酯等高效抗疟药物成分的生产，有效地降低了 ACT 治疗的价格，是合成生物学领域的经典案例，也对其他昂贵药物的合成生物学研究具有宝贵的借鉴意义[68].
　　
　　1.3.2.3二萜很多萜类是传统中药的关键药用成分，如丹参酮类化合物（tanshinones）属于松香烷型去甲二萜化合物，是中药丹参的主要脂溶性活性成分，通常由其前体次丹参酮二烯（Miltiradiene）和铁锈醇合成得到。中国医学科学院中药研究所黄璐琦课题组[69,70]通过功能基因组学技术从丹参中鉴定了两个次丹参酮二烯合酶 :Sm CPS（labdadienyl/copalyldiphosphatesynthase）和 Sm KSL（kaurenesyn-thase-like）。天津工业生物技术研究所张学礼课题组[71]将 Sm CPS 和 Sm KSL 整合到酵母基因组上，然后一方面过表达 t HMGR 抑制酵母中 FPP 向麦角固醇的合成 ;另一方面则过表达 ERG20-BTS1-Sa GGPS和一个固醇调节因子 UPC2.1,使得次丹参酮二烯的合成达到了 61.8mg/L,分批发酵的方式能将次丹参酮二烯的合成进一步提高到 488mg/L.中国科学院大连物理研究所赵宗保课题组[72].在采用合成生物学生产次丹参酮二烯的过程中，提出了一种新的模块途径工程（modularpathwayengineering,MOPE）策略，通过将次丹参酮二烯合成途径的 4 个关键酶进行融合表达，包括催化 FPP 合成的 ERG20（farnesyldiphosphatesynthase）、将 FPP 转化成 GGPP 的 BTS1（GGPPsynthase）以及两个次丹参酮二烯合酶 Sm CPS和 Sm KSL 的融合，使得次丹参酮二烯的合成代谢流更加高效，最终构建出了高产次丹参酮二烯的酵母工程菌株，产量高达 365mg/L.随后，他们利用第二代 DNA 测序技术鉴定了 6 个与丹参酮积累相关的 CYP450 基因，并通过基因表达和体外酶活筛选发现，CYP76AH1 负责催化次丹参酮二烯转化生成铁锈醇。通过从中药丹参中克隆不同的 CPR,进行 CYP450 和 CPR 等模块元件间的适配性分析，鉴定出 Sm CPR1（Salvia miltiorrhizaCPR）为更合适的CYP76AH1 辅酶，最终使得摇瓶培养条件下酵母细胞合成铁锈醇的产量达到 10.5mg/L[73].随着深度测序、代谢组学以及转录组学技术对丹参的基因组、转录组和代谢组数据的挖掘，越来越多的与丹参酮合成通路相关的基因被鉴定出来，这些数据为丹参酮的合成生物学研究奠定了扎实的理论基础[74-77].丹参酮合成生物学的研究对于其他药用、食用萜类的异源合成将具有重要的参考价值[78].
　　
　　1.3.2.4三萜三萜人参皂苷是人参中的主要有效成分，属于糖苷类化合物，包括齐墩果烷型无环三萜类皂苷和达玛烷型四环三萜类皂苷，后者又包含人参二醇型皂苷和人参三醇型皂苷。人参皂苷在人参和西洋参中的含量很低，大大限制了它的临床应用。因此，通过合成生物学技术生产人参皂苷已经成为研究热点。人参皂苷生物合成包含 20 余步酶促反应。目前，已经从人参属植物中克隆出 20 多种与人参皂苷合成相关的基因，并进行了相应的功能验证 :鉴定出两种鲨烯环化酶--达玛烯二醇-II 合酶（darmmarenediol,DS）和β-香树素合酶（β-amyrinsynthase,AS），它们分别参与了 2,3-氧化鲨烯向达玛烷型和齐墩果烷型人参皂苷的合成过程[79,80];发现一种细胞色素酶 CYP716A47 参与了达玛烯二醇-II向原人参二醇（protopanaxadiol）的转变[81].中国科学院上海生命科学院周志华课题组[21]首次鉴定了一个来源于人参的 UDP-糖基转移酶（UGTPg1），通过在酵母中与 CYP716A47 及其辅酶 ATR2-1 同时过表达，实现了人参二醇型皂苷 CK 的从头合成。周志华课题组与赵宗保团队的萜类生物合成研究均属于以中国科学院上海生命科学院赵国屏为首席的“新功能人造生物器件的构建及集成”973 项目，该项目在萜类的异源合成上已经取得了多项重要进展。此外，北京理工大学李春课题组在酿酒酵母中将来源于光果甘草的β-香树素合酶，以及IDI1、ERG20、ERG9、ERG1 等促进 2,3-氧化鲨烯合成的酶的基因同时进行过表达，并将表达质粒同源重组到染色体中提高基因表达的稳定性，实现了齐墩果烷型人参皂苷前体β-香树素的合成。除此之外，该项研究还有两点重要发现，在表达质粒的启动子上构建固醇调控元件 SRE（-TCGTATA-）是一种有效的上调固醇类蛋白表达的转录调控方式 ;在补料分批培养中，以乙醇作为补料与以葡萄糖作为补料相比，可以显着提高β-香树素的合成产量，最终达到138.8mg/L[82].
　　
　　2展望
　　
　　萜类化合物的生物功能和药物活性使其在食品、日化、医疗等领域具有广泛的应用价值，因此，萜类化合物的高效合成具有广阔的市场前景。通过对萜类的生物合成途径的鉴定研究，设计开发出一套组合调控萜类合成途径的功能模块，并在底盘细胞中创建合成工厂，可以实现萜类的体外合成。因此，合成生物学的发展为实现微生物发酵生产食用、药用萜类提供了有力的支撑。
　　
　　为提高萜类化合物的生物合成效率，实际操作过程中应考虑以下几个关键因素 :萜类前体的含量、引入的萜类合酶的亚细胞定位、萜类合酶的活性、萜类合成通路的旁支通路，以及萜类化合物的生物毒性。此外，在“模块途径工程策略”快速组装代谢途径的基础上，还可以通过优化前体供给、细胞色素还原酶匹配、宿主选择、发酵优化等操作，构建高产酵母工程菌株，最终实现目标产物的高效生产。任何一项学科的迅猛发展都不是孤立封闭的，因此，为快速推进合成生物学技术的发展，未来应加强以下几个学科和技术的应用 :（1）结合转录组学、蛋白质组学、代谢组学等多种功能组学方法，对现有的生物系统和代谢网络进行更加全面的了解；（2）通过结构生物学对合成途径的关键元件进行结构解析，了解具体催化机制 ;（3）通过定向进化和理性设计等蛋白质工程对关键酶进行改造，包括提高关键酶的活性、增加酶的新功能等 ;（4）从生物反应动力学角度出发，对合成途径的元件模块进行复合体组装以提高生物反应速率 ;（5）采用计算生物学技术辅助分析整个代谢系统，通过调整代谢流、抑制旁支通路、解除反馈抑制等手段提高目的产物的生产 ;（6）利用最新的先进技术如 CRISPRi 等对底盘细胞进行内源基因的有效敲除及最小基因组的快速构建 ;（7）借鉴发酵工程多尺度（基因、细胞、反应器）调控策略，在后期发酵过程考虑细胞生长与产物合成之间的平衡，从而实现反应过程的优化放大 ;（8）借助 Amyris 等大型合成生物学公司辅助搭建更为成熟、自动化的合成生物学平台，加速该领域的工业化应用和产品的开发[83].综上所述，采用合成生物学策略合成萜类化合物，有望成为植物源萜类生产的有效技术手段。