双氧水预处理对氧化损伤的H9c2心肌细胞的保护机制

　　前言

　　心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia reperfusion in-jury，MIRI）是指心肌缺血/缺氧一段时间，当重新恢复血流或血氧供应后，心肌细胞功能代谢障碍及结构破坏反而较缺血/缺氧时进一步加重、心功能进一步恶化的病理生理过程。细胞内既有活性氧等氧化系统，也存在清除活性氧的抗氧化酶系统，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等。在生理状态下，体内的氧化系统和抗氧化系统处于动态平衡状态，不会导致损伤。然而，缺血再灌注阶段会产生大量活性氧，而机体又无法完全清除，这些过量的活性氧就会引起一些重要的生物大分子的氧化损伤，从而诱导心肌细胞凋亡和坏死。目前认为活性氧介导的氧化损伤是引起心肌缺血再灌注损伤的重要原因。

　　然而近年来大量研究表明，H2O2预处理能保护PC12细胞抵抗氧化损伤，抑制氧化损伤导致的细胞凋亡。Guo等研究还发现活性氧可作为抗氧化酶第二信使激活级联反应，增加SOD、CAT等抗氧化酶活性，清除活性氧，从而起到抗氧化损伤的保护作用。对于氧化损伤的H9c2心肌细胞，目前尚不清楚低浓度H2O2预处理是否具有保护作用以及能否上调抗氧化酶活性。本研究通过构建大鼠H9c2心肌细胞氧化应激损伤模型，给予低浓度H2O2预处理，以探讨低浓度H2O2预处理对氧化损伤的H9c2心肌细胞的保护作用及其机制。目前，对于缺血再灌注损伤的防治尚无有效办法，本研究在不改变损伤因子性质的情况下，通过适宜浓度的活性氧进行预处理，激活机体自身的抗氧化防护机制，从而加强细胞对氧化损伤的抵抗能力，这种主动性抵抗作用将为临床防治缺血再灌注损伤提供了一种新的思路。

　　1、材料与方法

　　1.1材料

　　大鼠心肌细胞系（H9c2）购自中国科学院细胞中心。高糖DMEM为GIBCO公司产品，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶、Hoechst 33258购自Sigma公司，CCK8试剂盒购自江苏碧云天公司，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，An-nexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自奥地利Bender MedSys-tems公司，其他试剂均为国产分析纯试剂。

　　1.2实验方法和步骤

　　1.2.1细胞培养和预处理方法将H9c2心肌细胞培养于含15%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养，选对数生长期的细胞进行实验研究。H2O2预处理按以下步骤实施：25μmol/LH2O2作用90分钟后，换为含15%胎牛血清的高糖DMEM培养液继续培养24h，PBS漂洗2遍，然后给予2%FBS的高糖DMEM稀释配置的400μmol/LH2O2处理6h。

　　1.2.2丙二醛（MDA）测定收集四组细胞，分别用200μL的1%Triton X-100进行充分裂解，15,000转/分离心10min，收集上清，取100μL上清，严格按照MDA试剂盒说明书操作，测定各管吸光度，按照公式计算得出各组MDA含量。

　　1.2.3总超氧化物歧化酶（T-SOD）测定收集三组细胞，分别用200μL的1%TritonX-100进行充分裂解，15,000转/分，离心10min，取50μL上清，严格按照T-SOD试剂盒说明书操作，BCA法测定样品蛋白浓度，酶标仪检测各组吸光度，按照公式计算出各组的SOD活性。

　　1.2.4CCK8法检测细胞存活率将H9c2心肌细胞按6×104/ml接种于96孔板，每孔100μL，细胞融合生长至80%左右，实验分组要求处理各组细胞，每孔加入10μL的CCK8液继续培养2h，在酶标仪450nm处，测定每孔的吸光度值，从而计算H9c2细胞的存活率。

　　1.2.5Hoechst33258染色观察凋亡形态变化按照5×104/ml接种于24孔板，细胞融合生长至60%左右，经过相应处理，弃旧培养液，PBS轻轻漂洗1次，加入4%多聚甲醛固定15分钟，PBS漂洗1次，2.5μg/ml的Hoechst 33258室温避光染色15分钟，PBS轻轻漂洗3次，每次5分钟，然后每孔加400μLPBS上荧光显微镜下观察并拍照。

　　1.2.6Annexin-V/PI双染色流式细胞仪检测凋亡率采用25cm2培养瓶培养心肌细胞，细胞生长至70%左右给予不同处理后，进行胰酶消化，离心收集细胞，4℃预冷无菌的PBS漂洗细胞2遍，每组取总数为1×106/ml的细胞待检测，用250μL结合缓冲液重悬细胞，并使其浓度为2-5×105/ml，取190μL细胞悬液加入10μL的Annexin V-FITC，间隔3分钟，再加入10μL浓度为20μg/ml的碘化丙锭（PI），混匀后于室温避光孵育15min，在流式反应管中加入400μLPBS，轻轻混匀，上流式细胞仪检测分析。

　　1.3统计学分析

　　采用SPSS17.0统计软件，计量资料均采用x±s表示。多样本均数比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，两两间均数的多重比较采用LSD检验，以P<0.05有统计学差异。

　　2、结果

　　2.1H2O2预处理对氧化损伤H9c2细胞存活率的影响400μmol/LH2O2处理H9c2心肌细胞6h，造成H9c2细胞的存活率降低至（60±5）%，与正常对照组（100%）相比，两者有显著性统计学差异（P<0.05）。而应用25μmol/LH2O2预处理90min能明显对抗400μmol/LH2O2氧化损伤降低细胞存活率的作用，能使细胞存活率提高到（85±7）%，与损伤组比较具有统计学差异（P<0.05）。25μmol/LH2O2处理H9c2细胞90min的细胞存活率为（98±2）%，与正常对照组相比无统计学差异（图1）。

　　2.2H2O2预处理对H9c2细胞氧化损伤的影响正常对照组（CTL组）H9c2细胞的MDA含量比较低为1.9±0.33nmol/mg，损伤组MDA的含量明显升高达6.8±0.56nmol/mg，与损伤组比较，25μmol/LH2O2预处理后的MDA水平明显升高达4.8±0.4nmol/mg（P＜0.05），PC组与损伤组相比，MDA含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图2.A）。CTL组H9c2细胞的SOD活性为176±6.48U/mg，损伤组细胞的SOD活性显著降低达122±11.73U/mg；与损伤组比较，PC组SOD活性明显升高，数值为160±10.27U/mg（P<0.05）（见图2.B）。

　　2.3H2O2预处理减轻氧化损伤诱导的凋亡细胞形态学变化正常对照组的H9c2细胞，光镜下细胞呈梭杆形，排列整齐，肌束样，细胞间隙紧密（图3A），荧光显微镜下细胞核呈现大小均一，均匀荧光，无核固缩，为体积稍大的暗染核形态（图3B）；400μmol/LH2O2处理6h，导致细胞皱缩、细胞外观形态扭曲（图3A），细胞核染色质凝集，核固缩，核碎裂，呈现体积小而亮的核形态（图3B）；而25μmol/LH2O2预处理能明显减轻400μmol/LH2O2引起的以上形态变化（图3A和图3B）。

　　2.4H2O2预处理减少氧化损伤心肌细胞凋亡率流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，正常对照组凋亡率为（1.25±0.14）%，损伤组凋亡率为（14.8±1.06）%，损伤组与正常对照组相比较有统计学差异（P<0.01），PC组凋亡率为（6.42±0.71）%，与损伤组相比较有统计学差异（P<0.01）（见图4）。

　　3、讨论

　　溶栓、经皮冠状动脉介入治疗(PCI)、冠状动脉搭桥术等方法广泛用于临床急性心肌梗死的治疗，对于恢复心肌的灌注、缩小心肌梗死范围、保护心功能起着重要作用，但同时也出现了严重的再灌注损伤,研究发现急性心肌梗死冠脉再通后大约25%的心肌细胞死亡。如何防治心肌缺血再灌损伤，引起了人们高度的重视。目前认为活性氧是缺血再灌注损伤的重要发病学环节，是引起心肌缺血再灌注的关键诱导因素。在缺血再灌注损伤中，复灌时期会产生大量活性氧，导致细胞膜脂质过氧化、DNA损伤以及心肌细胞凋亡。H2O2是活性氧家族的重要成员之一，有关缺血再灌注损伤的研究多采用高浓度的H2O2来模拟氧化损伤模型。然而活性氧（ROS）除了具有促氧化损伤的不利影响外，最近研究还现低浓度活性氧具有信号转导和促细胞增殖作用，而高浓度活性氧促细胞死亡，且呈现明显剂量效应关系。本研究采用400μmol/LH2O2作用6小时来构建H9c2心肌细胞的氧化损伤模型，发现低浓度H2O2对H9c2心肌细胞无细胞毒性，经过25μmol/LH2O2对H9c2心肌细胞进行90分钟的预处理，细胞存活率明显升高，细胞凋亡明显减少，显示低浓度H2O2预处理具有显著的心肌保护作用。Mo等对氧化损伤的PC12细胞中也发现低浓度H2O2有明显的细胞保护作用。

　　活性氧是指在生物体内与氧代谢有关的含氧自由基和易形成自由基的过氧化物的总称，氧化性质非常活泼，ROS能导致心肌细胞膜脂质过氧化、蛋白质交联和降解、脱氧核糖核酸断裂以及线粒体功能障碍。生理条件下，机体不断产生活性氧，而体内的抗氧化系统不断清除活性氧，两者处于动态平衡中，不会损害机体；然而当出现有害刺激时，才会产生大量活性氧，抗氧化系统清除能力有限，最终导致氧化损伤的发生。

　　过量的活性氧与多种心血管疾病的发生发展有密切联系，例如动脉粥样硬化、高血压、心肌梗死和心力衰竭等，因此有很多学者在着手研究减轻活性氧损伤的策略。但是，近来有很多研究证实适量的活性氧是一种重要的介导保护作用的信号分子，具有积极的生理作用。Penna等认为适量ROS可作为信号分子，参与缺血前处理和缺氧后处理的心脏保护作用信号通路，介导心肌保护作用。活性氧还是缺血后处理心肌保护作用信号通路的组成部分，参与传导抗凋亡的保护作用。本研究中低浓度H2O2对氧化损伤的心肌细胞保护的同时，伴有SOD活性明显升高，提示H2O2预处理可能通过增加SOD的活性，进而抵御氧化损伤。

　　综上所述，25μmol/LH2O2预处理可以增加心肌细胞存活率，减少细胞凋亡形态的发生，降低氧化损伤的凋亡率，增加SOD的活性，减少MDA的含量，对于氧化损伤的H9c2心肌细胞具有很好的保护作用，其机制可能是适量的活性氧作为抗氧化酶的信号分子，增加SOD的活性，清除过量的活性氧，从而保护细胞抵抗氧化损伤。本研究也揭示了通过适量活性氧激活自身抗氧化机制抵御氧化损伤成为可能，为有效防治缺血再灌注损伤提供了新方法和实验基础，通过调动机体自身防御系统来主动防治疾病的研究将会成为新的热点，将会对人类健康产生积极影响。下一步我们将着手研究PI3K/Akt、ERK等信号通路是否参与介导低浓度H2O2预处理的抗氧化作用，以明确低浓度H2O2预处理保护心肌细胞抵抗氧化损伤的详细机制。