沼水蛙抗菌多肽brevinin-2GHa1的分离提纯及其结构研究

　　在自然环境下，两栖动物受到紫外线、病原微生物的伤害及捕食者的威胁． 面对恶劣的自然环境，两栖动物体表进化出许多特殊的腺体，这些腺体能够分泌丰富多样的生物活性肽，如抗氧化肽、抗菌肽、抗病毒多肽等，其中的抗菌肽研究已取得诸多进展． 有研究者仅从 Odorrana grahami 中就发现了107 种新型的抗菌肽． 目前已经发现的两栖动物抗菌肽已有上千种，研究者根据沼水蛙抗菌肽的氨基酸序列，将其分成 brevinin、esculentin、nigrocin 和odorranain 等不同家族． 多种抗菌肽相互配合，快速有效地消灭病原微生物，成为两栖动物生存繁衍的有效保障之一．沼水蛙学名 Hylarana guentheri，广泛分布于中国南部和一些东南亚国家． 沼水蛙皮肤能够分泌多种抗菌肽． 目前，已从沼水蛙皮肤分泌物中获得分别属于 brevinin、temporin 和 guentherin 家族的 9 种抗菌肽． 在不同的生活环境下，两栖动物会分泌不同的抗菌肽来适应新的环境，沼水蛙抗菌肽的开发利用需要更多研究． 本文通过电刺激法获取沼水蛙皮肤分泌物，利用凝胶过滤色谱和高效液相色谱进行分离纯化，获得了 1 种新的抗菌多肽 brevinin-2GHa1，并对其抗菌活性和溶液结构进行了研究．
　　
　　1 材料与方法

　　1. 1 材料

　　野生成年沼水蛙捕捉于福建省福清，数量 n =18，体长 80 ～ 90 mm; 三氟乙酸( trifluoroacetic acid，TFA) 、三氟乙醇 ( trifluoroethanol，TFE) ，购于德国CNW Technologies GmbH 公司; Sephadex G-50 凝胶过滤色谱填料购于美国 GE 公司; 甲醇和乙腈( 高效液相色谱纯) 购于德国默克公司; 其它试剂均为国产分析纯．LC-20A 岛津高效液相色谱，Gemini 5 μ C18 反相高效液相色谱柱( 250 mm ×4. 6 mm) ，J-810 圆二色谱仪，XZ-21K 型高速冷冻离心机，FD-1C-50 冷冻干燥机，752 型紫外可见分光光度计，TSQ-280 培养箱，BS-160A 自动部分收集器，BT01-100 蠕动泵驱动器，MILLI-Q 型超纯水机．
　　
　　1. 2 沼水蛙皮肤分泌物抗菌肽的分离纯化

　　提取沼水蛙皮肤分泌物: 电刺激法稍作修改． 市售 10 V 直流电池适度刺激沼水蛙耳后及背部腺体发达的部分皮肤，间隔 5 s 刺激 1 次，每次持续 1 s． 待实验个体皮肤表面产生大量分泌物，采用 0. 05% ( V/V) 三氟乙酸酸化，去离子水冲洗，收集冲洗液，离心 12 000 r/min，10 min，取上清液，置于-80℃冰箱迅速冷冻后做冷冻干燥处理，保存于-20℃备用．Sephadex G-50 凝胶过滤色谱: 去离子水溶解沼水蛙皮肤分泌物冻干粉，12 000 r/min 离心10 min．取上清液用 0. 22 μm 孔径的微滤膜过滤． 滤液上样用0. 5% ( V/V) 的三氟乙酸水溶液平衡的 SephadexG-50 凝胶柱( 1. 6 cm × 100 cm) 分离． 洗脱液为 0. 5%( V/V) 的三氟乙酸水溶液，流速0. 3 mL/min，每10 min收集1 管洗脱液，于214 nm 波长检测吸光值． 收集洗脱峰，冷冻干燥． 滤纸片法测定其抗菌活性，对有活性的组分进一步分离纯化．反相高效液相色谱: 去离子水重新溶解具有抗菌活力冻干组分，离心 12 000 r/min，10 min，收集上清液，经 0. 22 μm 滤膜过滤并上样至反相高效液相色谱． 液相色谱系统为 LC-20A，装配 Gemini 5 μC18( 250 mm × 10 mm) 反相柱 ( Phenomenex，UK) ．以含 0. 05% ( V/V) 三氟乙酸的乙腈水溶液为流动相，进 行 梯 度 洗 脱，检 测 波 长 214 nm，流 速 为1. 0 mL / min，洗脱时间 40 min． 洗脱梯度为: 0 ～5 min，20% 乙腈水溶液; 5 ～ 40 min，20%→70% 乙腈水溶液． 收集具有抗菌活性的峰，冷冻干燥后于-20℃ 保存备用．
　　
　　1. 3 抗菌活性的测定

　　纸片法测定跟踪样品的抑菌活力: 所用菌种为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌． 具体操作如下: 挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，过夜振摇培养( 37℃，130 r/min) ． 取 200 μL 过夜培养物接种于 20 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，振摇培养4 h ( 37℃，130 r/min) 获得菌悬液． 将菌悬 液 稀 释 1 000 倍 作 为 测 定 活 性 用 菌 液． 取100 μL加入倒置的平板表面，涂布均匀，在平板表面贴直径 5 mm 的滤纸片，滤纸片上加 10 μL 待测样品，浓度为 5 mg/mL． 庆大霉素作为阳性对照，无菌水作阴性对照． 将平板倒置于 37℃ 恒温培养18 ～ 20 h 观察结果．最小抑菌浓度测定: 采用微量稀释法测定样品最小抑菌浓度( minimal inhibitory concentration，MIC，定义为显着抑制细菌生长的最低浓度) ． 实验所用菌种为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌( 上述菌种均为本室保存) ．菌种复苏，接种斜面 37℃ 培养过夜，挑单菌落接种于普通 LB( Luria-Bertani) 培养基中，37℃ 培养过夜，稀释菌液使菌浓度为 1 × 104～ 1 × 105CFU /mL 备用． 将抗菌肽溶液按 2 倍浓度稀释，每孔抗菌肽体积为 100 μL，加入 100 μL 稀释好的菌悬液混匀，使每孔抗菌肽的终浓度分别为 2. 0，3. 9，7. 8，15. 6，31. 3，62. 5，125，250 μg / mL． 将 96 孔板置于37℃ 过夜培养，酶标仪检测 630 nm 波长的吸光值．当含有抗菌肽的培养液细菌生长浓度( A630) 与对照组培养液细菌生长浓度( A630) 比值小于 10% 时，认定抗菌肽在该浓度下对细菌有抑制作用． 能够抑制细菌生长的最小浓度即为 MIC．
　　
　　1. 4 沼水蛙抗菌肽一级结构测定

　　Edman 降解法是多肽和蛋白质测序中最可靠的方法之一． 根据埃德曼降解法原理，通过自动蛋白/多肽测序仪 ( 岛津，PPSQ-33A) 测定抗菌肽一级结构．
　　
　　1. 5 沼水蛙抗菌肽溶液结构研究

　　在室温下，用 J-810 圆二色谱仪测定样品在不同溶液中远紫外区的结构特征． 样品池光径 1 mm，扫描速度为 500 nm/min，扫描范围为 190 ～260 nm，扫描狭缝宽度为 4 nm，连续扫描 3 次取平均值，除去样品以外的相同溶液作为背景扣除． 试验中样品的终浓度均为 300 μg/mL．测定溶液对结构的影响: 采用去离子水、SDS水溶液( 10 mmol/L) 和 TFE( 100%) 为溶剂，测定样品在不同溶液体系的圆二色谱特征．测定 TFE 浓度对结构的影响: 采用不同浓度TFE / H2O( 5% ，10% ，20% ，30% ，50% ，100% ，V / V)溶液配制样品，测定样品溶液在不同 TFE 浓度下的二级结构变化．
　　
　　2 结果

　　2. 1 凝胶过滤色谱纯化

　　将沼水蛙皮肤分泌物冷冻干燥后重新溶解，采用 Sephadex G-50 凝胶过滤色谱分离． 测定洗脱液214 nm 波长吸光值，绘制洗脱曲线． 如 Fig． 1 所示，沼水蛙皮肤分泌物经凝胶过滤色谱获得初步分离，获得 2 个组分 F1 和 F2．平板涂布法检测组分 F1 和 F2 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用． 添加 F1 滤纸片周围有明显抑菌圈，表明 F1 对金黄色葡萄球菌( Fig． 2A)和大肠杆菌( Fig． 2B) 均有抑制作用，而添加 F2 滤纸片则未见抑菌圈，表明组分 F2 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均无抑制作用． 故收集组分 F1 进一步分离纯化．
　　
　　2. 2 反相高效液相色谱纯化

　　用 RP-HPLC 分离具有抗菌活力的 F1，收集了 6个组分( Fig．3) ，通过抗菌活性测定，发现峰 1 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用． 采用分析型C18 RP-HPLC 柱鉴定其纯度，峰 1 具有较高的纯度，因此选取洗脱峰峰1 进行序列测定．
　　
　　2. 3 抗菌肽结构分析

　　用氨基酸自动分析仪测定其一级结构，获得序列: Gly-Phe-Ser-Ser-Leu-Phe-Lys-Ala-Gly-Ala-Lys-Tyr-Phe-Leu-Lys-Gln-Val-Gly-Lys-Ala-Gly-Ala-Gln-Gln-Leu-Ala-Cys-Lys-Ala-Ala-Asn-Asn-Cys． 将 该 氨基酸序列与数据库( http: / /www． ncbi． nlm． nih． gov/BLAST) 中收录的抗菌肽序列进行比对，未发现相同序列，该抗菌肽为新型抗菌肽． 其序列和已知的brevinin-2GHa 序列高度相似( Fig． 4) ，属于 brevinin-2 家族，将其命名为 brevinin-2GHa1． 同 brevinin-2GHa 相比，brevinin-2GHa1 的 C 末端少了 1 个丙氨酸( Ala) ，且第 13 位的苯丙氨酸( Phe) 和第 16 位的谷氨酰胺( Gln) 分别取代了 brevinin-2GHa 的亮氨酸( Leu) 和丝氨酸( Ser) ．为进一步研究 brevinin-2GHa1 结构特征，用蛋白质分析网络服务器 NPS @ ( http: / /npsa-pbil．ibcp． fr / cgi-bin / npsa _ automat． pl? page = / NPSA /npsa_seccons． html) 在线预测其二级结构． 该抗菌肽的 C 末端 2 个半胱氨酸形成二硫键，因此，截取brevinin-2GHa1 的 Gly1-Ala26 部分进行预测．预测采用 King 等提供的方法，经过服务器分析，brevinin-2GHa 和 brevinin-2GHa1 在 Ser3-Ala26 部分都形成了 α-螺旋结构( Fig． 4) ．根据 α-螺旋的结构特征，将该部分结构绘制成轮状图( Fig． 5) ． 由轮状图可知，brevinin-2GHa1的疏水氨基酸和亲水氨基酸分别聚集于螺旋结构两侧，形成亲水面和疏水面． 由抗菌肽两亲性的 α-螺旋结构推测，其作用位点可能是细胞膜．
　　
　　2. 4 最小抑菌浓度测定
　　
　　以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌为检定菌，测定 brevinin-2GHa1 的最小抑菌浓度( Table 1) ． 结果表明，brevinin-2GHa1 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌都具有较强的抑制作用，而对沙门氏菌的作用较弱． 根据Zhou 等报道，brevinin-2GHa 仅对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有抑制作用，而对革兰氏阴性菌大肠杆菌无抑制作用． 尽管 brevinin-2GHa1 与 brevinin-2GHa 只相差 3 个氨基酸，但是brevinin-2GHa1 的 抗 菌 活 性 却 远 强 于 brevinin-2GHa． 有研究表明，具 α-螺旋结构抗菌肽疏水性对其活性发挥重要作用，疏水性较高的抗菌肽具有较好的抗菌活性． Temporin A 的 α-螺旋结构疏水面的 2 个 Ile 如用疏水性更弱的 Ala 取代，结果temporin A 的抗菌活性降低至原来的 12. 5% 以下． 与此相反，将抗菌肽 temporin-1Dra 的 α-螺旋结构疏水面的 Leu9 或 Ile13，用疏水性更强的环己基甘氨酸( cyclohexylglycine) 取代后，其抗菌活性提高 2 倍． 由于 brevinin-2GHa1 疏水面仅由 5 个氨基酸构成，因此，螺旋结构疏水区疏水性的强弱将显着影响其抗菌活性． Brevinin-2GHa1 的 α-螺旋内位于疏水面的 Phe ( F13) ，其疏水性大于 brevinin-2GHa 中 Leu ( L13 ) 疏水性，这可能是 brevinin-2GHa1 比 brevinin-2GHa 抗菌活性更强，抗菌谱更广的原因． 而 brevinin-2GHa1 疏水面不同疏水氨基酸的取代，对其活性影响的具体机制有待进一步研究．
　　
　　2. 5 圆二色性研究
　　
　　为了进一步阐明抗菌肽的抗菌机制，需要对抗菌肽在膜环境下的结构进行深入研究，常用的方法是测定多肽溶液在远紫外区( 190 ～250 nm) 的圆二色谱吸收． 在此波长范围内，肽键是主要的生色团，圆二色谱图随多肽二级结构的差异而呈现不同的特征形状，由圆二色谱图可以判断多肽的折叠方式．SDS 为阴离子表面活性剂，在水溶液中可形成两亲的带负电的胶束; TFE 可诱导和稳定多肽的螺旋结构，2 种物质的水溶液常作为细胞膜环境的简单模拟． 本文研究了多肽在水、10 mmol/L SDS 溶液和 100% TFE 中的结构特征． 由 Fig． 6A 可知，在水溶液中，brevinin-2GHa1 圆二色谱在 202 nm 附近有 1 个负峰; 而在模拟膜环境的 SDS 溶液和 100%TFE 中，brevinin-2GHa1 的圆二色谱在 208 nm 和222 nm 波长的负峰明显增强，圆二色谱吸收曲线呈“W”型． 圆二色谱图从 208 nm 和 222 nm 波长的负峰吸收是 α-螺旋结构的特征吸收，在一定条件下，溶液中的螺旋结构含量与上述波长的负峰吸收正相关．
　　
　　由圆二色谱图可知，在水溶液中，brevinin-2GHa1 主要是无规卷曲状态，在 SDS 和TFE 溶液中多肽主要是螺旋结构．TFE 分子中的 CF3基团使 TFE 呈现显着的疏水性，可与多肽疏水性氨基酸相互作用，诱导多肽螺旋结构的形成; 随着 TFE 浓度提高，TFE 聚集在多肽周围形成包裹效应，从而稳定多肽的螺旋结构． 本文通过测定抗菌肽在不同浓度 TFE 溶液中的圆二色谱吸收，研究 brevinin-2GHa1 在不同疏水环境下构象变化． 由 Fig． 6B 可知，随着 TFE 浓度升高，brevinin-2GHa1 溶液在 208 nm 与 222 nm 波长负峰吸收逐渐增强，表明随溶液环境逐渐接近细胞膜环境时，brevinin-2GHa1 由无序的线性结构折叠成两亲的螺旋结构( Fig．5) ，抗菌肽螺旋结构比例逐渐上升．
　　
　　3 讨论
　　
　　有研究表明，两栖动物个体基因、生存环境和食物组成等方面的差异，可能导致两栖动物皮肤分泌的抗菌肽不同，甚至同一两栖动物个体在不同的生命周期分泌的抗菌肽各有差异． 两栖动物抗菌肽丰富多样，形成一个巨大的抗菌肽来源库，具有重要的研究和应用价值．本文从沼水蛙皮肤分泌物中分离纯化获得的具有较强抗菌活性的抗菌肽 brevinin-2GHa1，它对革兰氏 阳 性 菌 和 阴 性 菌 都 有 较 强 的 抑 制 作 用．Brevinin-2GHa1 属于典型的 brevinin-2 家族，该家族抗菌肽最早从日本的黑斑蛙 Rana brevipoda porsa中分离获得，并主要分布在亚洲和欧洲． 与其它家族相比，Brevinin-2 家族的序列同源性较差，序列中有 4 个保守氨基酸残基 ( Lys15、Cys27、Lys28和Cys33) ，主要结构特征是 C 端的 7 个氨基酸残基形成 1 个由二硫键连接的环状结构( Rana-box 模体) ．Brevinin-2GHa1 与 brevinin-2GHa 都是从沼水蛙中分离获得的，并且二者的同源性很高，达到 90%，在C 端 都 有 2 个 半 胱 氨 酸 形 成 1 对 二 硫 键． 与brevinin-2GHa 不同的是，brevinin-2GHa1 的 C 端以半胱氨酸结束，是典型的 brevinin-2 家族抗菌肽的特征． 由于沼水蛙的生存环境和生命周期等原因，造成了两者在序列上的差异，它们可能由相似的基因编码． 尽管二者具有相似的序列，但是却具有不同的抗菌活性．
　　
　　相关研究表明，抗菌肽的活性与其分子量的大小、氨基酸种类及排布、电荷、疏水性和螺旋结构等相关． 关键氨基酸的取代对抗菌活性具有重要的影响．众多研究对抗菌肽的抗菌机制提出了大量的解释，其中抗菌肽结构的解析对抗菌机制的研究具有重要的推动作用． 研究表明，阳离子抗菌肽主要以α-螺旋结构穿膜，发挥抗菌作用． 为了阐明研究brevinin-2GHa1 可能的抗菌机制，采用圆二色谱方法研究其在不同模拟膜的环境中的二级结构． 结果表明，brevinin-2GHa1 在膜环境下折叠成 α-螺旋结构． 据此推测，当发挥抗菌作用时，brevinin-2GHa1先通过静电作用吸附到带负电荷的细菌细胞膜表面，然后在膜环境下折叠成两亲的 α-螺旋结构，从而干扰细胞膜磷脂层结构的稳定性，破坏细胞膜，最终导致菌体裂解死亡． 两栖动物中抗菌肽分布广泛，并且数量巨大，具有重要的研究价值． Brevinin-2GHa1 的研究结果不但丰富了沼水蛙抗菌肽的组成，并且对其抗菌机制的阐述提供了一定的结构基础，为进一步开发利用提供了重要的实验基础．【图略】
　　
　　参考文献( References)
　　
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