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质粒抽提策略对双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散的影响

来源:学术堂 作者:姚老师
发布于:2015-08-03 共3352字
摘要

  双酶切联合琼脂糖凝胶电泳是鉴定 DNA 重组成功与否的重要方法[1],琼脂糖凝胶电泳图像质量直接影响鉴定结果的判读、论文发表。条带弥散是图像质量不佳的主要表现之一,研究者多将其归咎于不合理的酶切和不规范的电泳操作[2],而很少报道质粒抽提策略对弥散的影响。笔者在双酶切鉴定葡萄糖6 - 磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphate dehydro-genase,G6PD)重组质粒 pET-28a-G6PD 时,发现质粒抽提策略对双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散有显着影响,现报道如下,以供参考。

  1 材料与方法

  1. 1 质粒与菌株

  含空质粒 pET-28a 的大肠杆菌 Top10 (pET-28a / Top10)由本教研室保存。重组质粒 pET-28a-G6PD 为笔者构建并转化至 Top10 感受态细胞中。

  1. 2 试剂与仪器

  质粒小量提取试剂盒、卡那霉素、50 × TAE 电泳缓冲液购自上海生工生物工程有限公司,快速限制性核酸内切酶为 Fermentas 公司产品,琼脂糖为Biowest 公司产品。酵母浸出粉、胰蛋白胨为 OXIOD公司产品。MilliQ 超纯水为 实 验 室 自 制。DNAmarker 为 TAKARA 公司产品。POWER Pac HC 高电流电源为 BIO-RAD 公司产品、GIS 凝胶成像仪为上海天能公司产品,DYCP-31DN 型电泳槽为北京六一仪器厂产品。

  1. 3 菌液培养

  将含 pET-28a 和 pET-28a-G6PD 的大肠杆菌Top10 分别划线于含 100 μg / ml 卡那霉素的 LB 平板中,37 ℃倒置培养 15 h.挑单菌落各 1 个,接种至 40 ml(装于 250 ml 三角瓶中)含 50 μg/ml 卡那霉素的 LB 中,于摇床内 37 ℃ 250 r/min 培养,用上述不含菌液的 LB 作为空白对照,用可见分光光度计测定 600 nm 处的菌液的光密度值(OD600),至OD600为 1. 6,停止培养。

  1. 4 取
  
  1. 4 ml 菌液抽提质粒

  利用质粒小量提取试剂盒抽提质粒。步骤如下:①分别从各瓶吸取菌液 1. 4 ml 至 1. 5 ml 管心管,室温 10 000 r/min,离心 30 s,弃上清;②加 250μl 溶液 P1,3 000 r/min 涡旋 1 min;③加 250 μl 溶液 P2,温和颠倒混匀 10 次,室温静置 4 min;④加入350 μl 溶液 P3,温和颠倒混匀 10 次;⑤室温 12 000r / min 离心 6 min;⑥取 750 μl 上清于另一 1. 5 ml 离心管,室温 14 000 r/min 离心10 min;⑦取600 μl 上清于吸附柱中,室温 9 000 r/min 离心 30 s;⑧弃滤液,向吸附柱中加500μl WD1,室温10 000 r/min 离心 1 min;⑨弃滤液,向吸附柱中加 500 μl wash buff-er,室温 10 000 r / min 离心 1 min;⑩重复⑨一次;瑏瑡弃滤液,将吸附柱置于收集管中,室温 13 000 r/min离心 2 min;瑏瑢将去盖的吸附柱置于灭菌的 1. 5 ml离心管,做好标记,向吸附柱中加入 80μl 灭菌超纯水,室温静置 2 min,13 000 r/min 离心 1 min,收集滤液,冰浴备用。

  1. 5 取 2 × 0. 7 ml 菌液抽提质粒

  分别从各瓶取菌液0. 7 ml 至1. 5 ml 离心管,平行抽提两份,按1. 4① - ⑥抽提质粒,将⑥后的两份平行抽提的上清各600 μl 收集于1. 5 ml 离心管,于同一吸附柱内分两次进行⑦,后续步骤与 1. 4 相同。

  1. 6 取 4 × 0. 35 ml 菌液抽提质粒

  分别从各瓶取菌液0.35 ml 至1.5 ml 离心管,平行抽提四份,按 1. 4 中① - ⑥抽提质粒,将⑥后的四份平行抽提的上清各 600 μl 收集于 5 ml 离心管,于同一吸附柱内分4 次进行⑦,后续步骤与1.4 相同。

  1. 7 质粒的双酶切反应

  1. 4 ml,2 × 0. 7 ml,4 × 0. 35 ml 菌液抽提的pET-28a 经 NanoDrop 2000 测定浓度分别为 116,125,130 ng / μl;pET-28a-G6PD 的浓度分别为 120,134,145 ng /μl.用灭菌超纯水将所有质粒稀释至116 ng / μl.酶切体系:空质粒( 或重组质粒) 1 μg,Nde Ⅰ、Xho Ⅰ各 1 μl,10 × FD Green Buffer 2 μl,加水至 20 μl.混匀,37 ℃酶切 1 h.

  1. 8 双酶切质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定

  配制 1. 2% 的琼脂糖凝胶。将 2 μl 1 kb DNAladder marker(与 13 μl 1 × TAE 及 3 μl 6 × LoadingBuffer 混匀)、双酶切的 pET-28a、双酶切 pET-28a-G6PD 全量加入上样孔,130 V 电泳 30 min.

  1. 9 质粒纯度的测定

  利用 NanoDrop 2000 测定三种策略抽提的质粒pET-28a 和 pET-28a-G6PD 的 OD260、OD280值,评估质粒纯度。1. 3 - 1. 9 的实验进行 4 次重复(独立实验)。

  2 结果

  2. 1 双酶切后的质粒电泳图谱

  按策略 1. 4,1. 5,1. 6 抽提的质粒酶切后电泳图谱见图1.可知,按1. 4 策略抽提的质粒 pET-28a 和pET-28a-G6PD 双酶切后均严重弥散,尽管第 2 泳道中酶切产生的大片段(略大于5 000 bp)、小片段(介于1 000 -2 000 bp)分别与 pET-28a(5 239 bp)、G6PD分子量(1 548 bp)相符,但其相对亮度与理论不符;按1.5 策略抽提的 pET-28a 酶切后在 <1 000 bp 范围内弥散明显减少,pET-28a-G6PD 酶切后的弥散有明显改善,大片段的亮度明显高于小片断;按 1. 6 策略抽提的 pET-28a 和 pET-28a-G6PD 酶切后的弥散几乎完全消失,pET-28a-G6PD 酶切产生的大、小片段亮度比值接近理论值。

  2. 2 质粒纯度测定

  策略1. 4,1. 5,1. 6 抽提的质粒 pET-28a 和 pET-28a-G6PD 的 4 次实验的 OD260/ OD280平均值分别为1. 36 和 1. 45,1. 65 和 1. 70,1. 75 和 1. 78.可见,菌液越少,质粒的纯度越高,所含蛋白杂质越少。

  3 讨论

  质粒的双酶切和琼脂糖凝胶电泳的原理简单,易于掌握;但要获得理想的琼脂糖凝胶电泳图片,需要在多个环节上下功夫。导致电泳图片效果不佳的原因很多,有些无法从文献找到答案,需根据具体情况分析,并用实验检验。酶切后弥散是琼脂糖凝胶电泳常见的实验现象之一,导致弥散的原因有:①质粒 DNA 中含有 DNase,在酶切缓冲液的 Mg2 +作用下激活,水解质粒[3].②不正确的酶切,如酶用量过多、酶切时间过长、酶切缓冲液错误,导致质粒被切碎。③不合理的电泳缓冲液,如缓冲液陈旧、缓冲液配制错误(如 pH 和盐离子浓度错误)。④琼脂糖凝胶配制错误。

  本研究所用菌株 Top10 为 end A (编码非特异性 DNA 内切酶Ⅰ)突变型,同时溶解质粒的超纯水均为灭菌后一次使用,可排除 DNA 酶对质粒的降解。随着优质的限制性内切酶及其通用缓冲液的出现,酶切操作极为简便,不正确酶切发生的概率很小。即用型商品化电泳缓冲液的推出,极大减少了因缓冲液和琼脂糖配制错误所致的弥散。为此,笔者推测电泳弥散与上述四个原因无关,可能是质粒纯度低所致。

  虽然试剂盒法提取质粒速度快、纯度高[4],但仍有不少细节需要在操作时注意。如说明书要求取过夜培养的菌液 1. 5 - 5 ml 用于质粒的抽提,其中过夜培养是一个模糊时间,8 - 16 h 均可认为是过夜培养,不同过夜培养时间导致的菌液浓度相差悬殊。此外接种时菌落的生长状态和大小,以及菌株的生长速度均会导致相同培养时间菌液浓度不一。

  故需要摸索菌液用量,调整抽提策略,而不能"尽信书".在按照 1. 4,1. 5,1. 6 的策略抽提时,发现向1. 4 ml 菌液所含菌体中加入溶液 P2 裂解后,需要在颠倒混匀后静置 4 min,菌体才变为透明的溶液;用 0. 7 ml 或 0. 35 ml 菌液抽提质粒时,加入溶液 P2颠倒混匀后,立即变为澄清溶液,无需静置,且三种策略裂解的菌液澄清度依次增加。如只取 1. 4 ml菌液抽提质粒,不进行菌液用量的比较,很容易认为1. 4 的透明溶液就是澄清溶液,就继续后续的操作步骤。

  如不测定质粒纯度,贸然进行酶切操作,极易导致酶切鉴定图片质量不佳,甚至导致无法观察到酶切产生的目的条带,严重影响结果的判断。同时,不纯的重组质粒严重影响测序[5].纯度测定表明,等量的菌液分成小份多次抽提所得到的质粒纯度逐步提高,酶切后电泳弥散现象逐步消失。其原因可能是分次抽提时,菌体充分裂解,蛋白和基因组 DNA充分变性,在加入溶液 P3 后变性的蛋白和基因组DNA 沉淀更完全,故蛋白质和基因组 DNA 污染减少;同时因裂解单位质量的菌体所用的溶液 P1(含有 RNA 酶)增多,RNA 也清除得更彻底。

  总之,通过本文的研究,笔者发现采用双酶切联合琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒时,质粒的抽提策略对酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散有显着影响。用过多的菌液抽提质粒,因裂解不充分,导致菌体蛋白等杂质难以去除,所提质粒纯度低,易导致双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散。

  参考文献:
  [1] 蒋俊豪,贺修胜。 PCR - 双酶切鉴定 STGC3 抑癌基因重组子假阳性研究[J]. 现代生物医学进展,2007,7(6):819 -823.
  [2] 曹秀华,王亚婷,李丽,等。 琼脂糖凝胶电泳的条件优化-质粒DNA 重组片段的限制性内切酶谱鉴定[J]. 齐齐哈尔医学院学报,2011,32(01):9 -11.
  [3] 萨姆布鲁克 J,拉赛尔 DW. 分子克隆实验指南[M]. 3 版。 黄培堂,译。 北京:科学出版社,2002:35.

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