血小板circRNA的作用与研究策略

　　摘    要：　血小板环状RNA (platelet circular RNA, platelet circRNA) 是一类在血小板中由RNA反向剪切封闭形成的环形RNA分子, 具有结构稳定、丰度高以及细胞、组织特异性.血小板环状RNA可以参与细胞内RNA调控网络, 与疾病的发生和发展密切相关, 可能成为新型的生物标记物及治疗靶点.近年来, 关于血小板环状RNA产生、调控、生物学特性、功能及其与疾病的关系等均取得了初步的研究进展.本文将对血小板环状RNA的研究进展予以综述.

　　关键词：　血小板环状RNA; 研究进展; 生物学作用;

　　Abstract：　Platelet circular RNA (platelet circRNA) is a kind of circular RNA molecules formed by RNA "backsplicing" and closing, which has stable structure, high abundance, and cellular and tissue specificity. Platelet circRNA can regulate intracellular network, and is closely related to the occurrence or progression of various diseases. Its difference in expression may make it to be ideal biomarker and therapeutic target. In recent years, research achievements on its production, regulation, biological characteristics, functions as well as its relationship with diseases have been made. Here we present a review of progress in platelet circRNA research.

　　Keyword：　platelet circular RNA; research progress; biological function;

　　环状RNA (circular RNA, circRNA) 是一类在真核细胞中广泛存在的非编码RNA, 结构稳定, 与多种疾病的发生发展、生物组织发育及细胞衰老等相关, 具有广阔的应用空间[1].circRNA具有细胞类型特异性表达的特点, 如在脑和体液 (血液) 中.Memczak等[2]对人类外周全血中的RNA进行测序, 结果显示超过100种circRNA的表达量明显高于对应的m RNA.另外有研究在人类唾液中发现circRNA, 这提示circRNA在不同生物样本中的表达差异使其可能成为用于疾病诊断、组织发育鉴定等方面理想的生物标记物, 并有可能成为有效的治疗靶点.

　　血小板 (platelet, PLT) 是哺乳动物血液中的有形成分之一, 是从骨髓成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质[3], 血小板寿命很短, 只有8～11天, 在止血、促进伤口愈合和新生血管的生成中具有重要作用, 没有细胞核的血小板抑制了RNA的新陈代谢[4]但却仍然可以进行翻译[5], 而且含有多种非编码序列, 如转运RNA (t RNA) 、微小RNA (microRNA) 和长链非编码RNA (long noncoding RNA) [6].最近研究提示, 血小板中含有大量的circRNAs.RNA测序数据显示, circRNAs在人类血小板中的表达量是对应有核组织的17～188倍, 外显子含量是对应有核组织的12.7倍, 而且在人和小鼠中均存在circRNAs的差异性表达[7,8].血小板属无核细胞, 其转录组已失去超过90%的前体mRNA[9], 而血小板circRNA被认为在血小板转录中具有重要的作用[10].血小板circRNA的表达量丰富, 其必将具有重要的作用, 因此我们就血小板circRNA的研究进展作如下综述.

　　1 血小板circRNA的产生机制

　　在血小板中DNA可以转录形成不成熟的mRNA (pre-mRNA) , 然后剪接形成成熟的mRNAs, mRNAs发生转录后迅速被降解, 这也就解释了为什么转录组与蛋白质组表达之间并不一致[11], 在这一过程中如果发生了血小板mRNA反向剪接形成环状结构就形成了circRNAs (图1) [9].我们观察到, 相对于有核细胞, 在血小板中含有大量的circRNAs, 所以circRNAs的形成很有可能是线性mRNA退化的一种形式.另外, 血小板中大量的circRNAs是否是在巨核细胞中产生的呢?circRNAs在成熟的血小板中的含量要远远多于血小板的前体细胞巨核细胞, 而且巨核细胞中缺乏circRNAs从头合成基因的转录, 说明circRNAs是在血小板中形成的而不是来自于巨核细胞.另外, circRNAs连接点基因MAN1A2在血小板中的表达量要远远高于其线性m RNA, 这又为circRNAs的形成提供了有利的条件[11].与此同时多个信号通路也参与到了circRNAs的形成过程[12].RNA结合蛋白如Quaking和Muscleblind可以通过与circRNAs的侧翼序列motif相结合来调控人类circRNAs的生物学特性, 敲减Quaking的表达后会同时降低circRNAs的表达水平[13].

　　Fig.1 Possible mechanisims for formation of platelet circRNA[9]图1血小板circRNA的产生机制[9]

　　E:外显子;F:上游;I:内含子;m7G:7-甲基鸟嘌呤核苷酸帽子;R:下游.

　　2 血小板circRNA的作用及作用机制

　　血小板中表达多达3 324种circRNAs, 如此丰富的circRNAs必然会具有重要的生物学功能及作用, 现就目前研究所提及的血小板circRNA的作用及作用机制总结如下:

　　2.1 血小板circRNA与miRNA相互作用

　　血小板中的microRNA (miRNA) 具有重要的调控作用[4], 血小板circRNA的3′UTRs区长度是有核细胞的2倍 (1 047个核苷酸vs 492个核苷酸) [14], 而3′UTRs区又含有miRNA结合位点, 从而与miRNA相互作用.在有核细胞中, circRNAs充当了miRNA海绵的作用, 在血小板中含有大量的circRNAs和miRNA也具有类似的功能而发生相互作用[15].

　　2.2 血小板circRNA具有调节转录的功能

　　Maass等[16]研究表明, 血小板中circRNAs的表达水平高于其他组织, 如:circRNA ACVR2A、SMARCA5、PTPN12和TTN的表达水平远远高于其mRNA水平.血小板circRNA SMARCA5与其线性mRNA之比可达151∶1.鉴于血小板缺乏细胞核却可以发生转录和翻译[17,18], 有研究者假设circRNAs可以作为翻译的模板来调控转录, 并在人和苍蝇中得到了证实[19].

　　2.3 血小板circRNA可以作为检测mRNA稳定性及血小板寿命的标志物

　　circRNAs在人类血小板中含量丰富, 用RNase R消化去除线性mRNA后血小板中的circRNAs含量还要比有核组织高14～26倍.在血小板中, circRNAs的含量与mRNA稳定性密切相关, mRNA越稳定其环化形成circRNAs的可能性越大, 所以circRNAs的表达量也就间接反映了mRNA的稳定性.也有研究证实了阻止转录可以增加circRNA水平[20].而且, 血小板circRNA可以抵抗核酸外切酶的降解, 相对于线性的mRNA更适合作为基因组缺少转录时检测mRNA稳定性的标志物.另外, 有研究表明血小板circRNA可能影响血小板的功能和寿命[21], 所以血小板circRNA可以作为判断血小板寿命长短的一种标志物.

　　2.4 血小板circRNA可以作为一种新型诊断标志物

　　血小板可以释放大量的细胞外囊泡 (EVs) , EVs被认为是RNA的一种降解途径, 循环血浆中25%的EVs来自于血小板[22,23].所以, 对于EVs功能及内容物的研究已经成为当前研究的一个新热点.有研究通过密度梯度离心法获取血小板来源的外泌体和EVs, 进一步进行RNA-seq测序发现, 血小板中的circRNAs都可包装入外泌体和EVs中, 并可选择性释放出来, 表明其存在特殊的分选机制, 如:血小板特异性circRNA Plt-circR4就不能被优先释放进外泌体, 而ASAP1来源的circRNA就可以在EVs中优先释放.鉴于血小板在止血, 伤口愈合和癌症转移等方面都具有重要作用, 提示血小板circRNA在这些过程中可能具有重要功能, 是非常有潜力的诊断标志物, 极具研究价值[24].如在腺苷脱氨酶缺乏性严重免疫缺陷 (adenosine deaminase-deficient, severe combined immunodeficiency ADA-SCID) 中可以检测到ROBO1、CDC42BPA和TNFRSF11A来源的circRNA, 在湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合征中可以检测到ROB1和CDC42来源的circRNA.而且血小板本身就可以作为一种外泌体, 选择性地传递某种特异的circRNAs对于来自周围环境的信号做出相应的反应, 被称为“tumour-educated”血小板[25], 所以血小板circRNA将有可能成为判断血小板生物学功能及相关疾病诊断的新型标志物.

　　3 血小板circRNA的研究策略

　　血小板circRNA来源于血小板, 研究它就首先要从外周血中分离血小板, 分离血小板的方法较多, 可手工制备也可应用全自动血细胞分离仪及其配套设备一次性分离血小板[26].对于分离血小板来源的EVs中circRNA的方法也已有详细报道 (图2) [24].然后从分离出的血小板中提取总RNA并逆转录成cDNA后应用相应circRNAs引物扩增出目的circRNAs, 用于后续研究.目前, 关于circRNAs表达及功能研究的技术手段已经比较成熟和深入, 血小板circRNA作为circRNAs的一种同样适用于circRNAs的研究方法, 其主要研究技术包括了实时荧光定量PCR (quantitative realtime PCR, q RT-PCR) 、基因芯片分析 (genechip analysis) 、RNA印迹 (Northern blot) 、荧光原位杂交技术 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 及生物素偶联circRNA捕获 (biotincoupled circRNA capture) 等.除检测circRNA自身的表达外, 使用这些表达分析技术同时还可以检测circRNA与相关miRNA的表达量, 深入研究circRNA吸附miRNA分子的“海绵”作用, 也是相关研究需要关注的一个方向.此外, 还可以利用过表达或基因敲低的方法, 探究血小板circRNA在组织或机体中起到的作用, 但其他相关方法的研究尚需补充.

　　Fig.2 Isolation of platelet-derived EVs[24]图2血小板来源的EVs的分离方法[24]

　　TRAP:凝血酶受体激活肽;PBS:磷酸盐缓冲液;RT:常温;MWCO:截留分子质量.

　　4 问题与展望

　　目前circRNAs的研究已成为一大研究热点, 其研究方法和策略将为我们所关注的血小板circRNA的研究提供坚实的基础.而且血小板circRNA的表达特点和特性也提示其具有一定的研究前景.虽然相关研究尚有很多不足, 还不能断言血小板circRNA一定可以被应用于疾病的诊断与治疗及其他领域, 但血小板circRNA无疑是非常有价值的研究对象, 或许可以为circRNAs的研究与应用带来突破性进展.但是, 血小板circRNA的检测和应用尚存在一些问题.其一, 要成功检测到血小板circRNA首先要获得高纯度的血小板, 血小板的分离虽然不难但是就现有的分离血小板的方法和仪器来说尚有提升的空间, 血小板纯度的提高将更有利于我们从血小板中分离目的circRNA, 才能为后续的研究提供可靠的基础.其二, 由于血小板circRNA的系统研究及其与疾病的关系研究刚刚起步, 如果能将研究较为成熟的miRNA与血小板circRNA的关系探究得更加具体, 或许能找到血小板circRNA与疾病的直接联系, 就可为血小板circRNA与疾病的关系及其作为标志物领域的研究 (诊断、靶向治疗等) 打开一个新的局面.其三, 还有一些疑问有待于进一步研究, 例如:血小板中是否含有RNA结合蛋白基因, 在人类的上皮间质转化 (EMT) 中对大量的circRNAs进行调控[13]?在血小板中circRNAs应该不只是mRNA降解的产物, 它还具有哪些我们尚不清楚的作用[27]?血小板circRNA是否与种族、性别、年龄、健康状况相关?小动物模型 (如小鼠) 的血小板中是否含有circRNAs?如果有并且很丰富, 我们就可以进行体内研究.

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