基于微流控芯片技术的生物化学研究(2)

　　1个或多个信号激发一定的反应，这一反应进一步导致更多的下游反应并最终转变整体系统的命运.类似的例子有如下：（1）基因调控网络。其中部分基因连接信号转导通路，产生相应的基因活动.（2）细胞周期调控。一系列事件有序发生构成了细胞生长和分裂的过程.（3）癌症。参与调控细胞分裂的事件的蛋白质，不能适当地驱动细胞周期正常地从一个阶段发展到下一个。（4）获得性免疫系统.由先天免疫系统刺激进一步发展的免疫系统，保护机体抵抗病原体。

　　在2种状态间进行切换的机制在自然界中扮演。

　　了重要的角色，它可以标志生物事件的物理状态，也可以作用于菌群群体感应还可能是生物体进化的决策机制的一个基本单元。

　　利用切换现象所固有的性质，可以设计出用于检测目标分子或控制反应过程的人工系统，如DNA电路。它可利用可逆链置换反应建立复杂的数字逻辑电路，将多个"0"和"1"的逻辑门和开关都集成到一个放大的系统中。研究"合成生物学"是一个新领域，新研究目的是模仿或改进生物系统，并用较为简单的装置实现特定目的，上述基于转录的逻辑门和开关即其研究对象.

　　合成生物学正在快速发展，未来还会涌现出更多像生物开关这样的动态行为装置.微流控芯片和芯片实验室技术能为切换系统的研究提供独特的可精确控制的微环境，并提供高分辨率和高通量的手段。将微流体技术用于研究血液凝固的开关机制时，能精确控制反应时间、搅拌速率和表面化学性质.

　　在批量系统中一般必须进行多次实验才能确定阈值浓度，而微流控系统则可以通过并行发生多个反应来加速确定阈值的速度，特别是当阈值浓度受多个组分的调控时，微流控芯片还可以捕捉多个组分之间潜在的相互作用。

　　此外，切换系统还可用于设计模数转换检测系统。例如，一个模拟的化学信号可以被转换成一系列的"是"或"否"的数位，以指示样品中生物标志物是否超过一定的阈值浓度，这种应用使微流控检测设备能胜任生物标志物的临床检测。

　　此外，不只在空间上，微流体技术可以实现反应时间的"数字化",这种时间的数字化可用于建立化学放大网络。

　　然而，微流控技术也有许多的局限性。例如，由于微流控芯片比表面积较大，导致物质的吸附和蒸发会严重影响阈值测定的准确度和重复性。另外，在体内或在细胞水平，微流体芯片器件往往很难复制现实的自然生态系统中蕴含的复杂性.虽然有一些局限，微流控芯片技术还是提供了一种全新的手段，促进了对体外或简单的切换系统的研究；而且随着技术的成熟，它的应用必将拓展到更复杂的生化系统上，关于这一点，最近出现的芯片器官就是一个很好的预示.

　　2单一实体的"数字化"
　　
　　"数字"生物化学的另一个领域是对单一生物实体的分配和分析，这些生物实体可以是分子、细胞还可以是微生物等.在这一领域中，空间分配技术起着至关重要的作用.分配技术就是将溶液或悬浮液中的生物实体（如细胞）分配到不同的亚单位（图1B）。

　　由于分配的体积甚小，分配的亚单位数量极多，一般包含有单一生物实体的亚单位在总体中占有的比例很小，所以常需要用泊松分布统计来揭示分析对象的总量信息。微流控芯片技术是产生和控制这种亚单位的关键技术。液滴微流控技术是一种常用的用于研究单个生物实体的微流控技术.它通过在油相中产生单个分散的水相液滴而将生物实体分配在毫微升到微升范围的亚单位中。反应体系的微型化能促进反应试剂的快速混合，并且能实现对表面性质和反应时间的控制。

　　液滴微流控技术可以千赫兹的速率制造并控制这些微反应体系，从而给相应的反应体系研究提供了高通量的工具。分子、细胞器、细胞、甚至生物体（如线虫）都能够用该技术分配成单个的实体。大规模集成阵列（LS）I技术是另一种广泛用于研究单个分子和细胞的封装技术.

　　它以聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为芯片材料应用多层软光刻技术，整体制造出微阀阵列。该技术利用二元微阀阵列关闭时将流体通道网络划分成互相隔离的小室来实现单一实体的分配。经过筛选后，任意小室中包含的实体都可以选择性地从装置中分离。

　　还有一类分配技术是滑动芯片技术，它可以一步实现单一实体的分配。滑动芯片由2个可相对滑动的板块组成，通过创造和打破微流体通道来产生隔离单位，它没有有泵或阀的结构，对辅助资源要求较小。在飞升级小孔中对磁珠的单一分配的技术也相当成熟.这种技术首先用磁珠捕获单分子，然后把磁珠单独分配在飞升级微孔阵列中，从而提高小室中被分析分子的浓度，实现高通量的单分子分析.

　　另外，通过刻蚀在疏水基质上的亲水阵列也可以实现单分子的分配：使含有被分析分子的水溶液流过在亲水性微阵列，随后将水相换为油相，于是在亲水阵列上就会封装圆顶形的水溶液微滴，从而实现分配.使用微流体分配技术可以就单分子、细胞器、细胞以及生物体进行逐个研究，可以揭示被看似同质的群体所掩盖的现象.

　　单一生物实体的分析技术可实现特定实体的筛选和分离回收.微流体分配技术还为研究细胞内的生化过程提供了一个全新的工具，例如，有研究通过将爪蟾卵和胚胎胞浆进行一定体积的分配，来研究胞浆体积是如何影响纺锤体大小的.不同分子的共分配技术实现了单一生物实体层面的相互作用的研究，例如有研究者用数字PCR技术检测病毒的标记基因以研究病毒和细菌的相互作用.

　　除了微流控分配技术，还有其他的不需要分配的微流控技术可以实现单一生物实体分析，如结合了标记的光学超分辨显微术和流式细胞仪（FACS）对单细胞的研究，但是在分析细胞分泌的信号时，微流控分配技术仍具有优势.然而分配技术也有局限，比如，像生物分子在细胞内环境的网络功能这些复杂的相互作用，很难准确划分.

　　单一实体分配技术还可以实现诱导生化系统的切换，例如，数字ELISA和数字PCR已经成功地用于检测蛋白质和核酸的浓度.传统的"大量"模式（例如在管或微孔板系统中）是通过监测和比较生化反应的动力学参数来实现定量，这个过程没有明确的阈值导致切换。

　　如果在生化反应前对单一的实体实现分配，在每个单元中将产生一个明确的"是"或"否"的信号（取决于每个单元是不是包含有靶分子），这样就可以通过简单地计算2种状态的比例而实现定量，这个过程中，无需监控反应动力学参数.这个领域的应用发展快速，如Quanterix公司实现了数字ELISA的商业化应用，其检测灵敏度比传统ELISA高得多。此外，已经有多家公司已经将数字PCR技术推向市场，并实现了大量成熟的应用。

　　非切换系统数字化具有简单性和耐用性的显着优势，数字化技术中对"是"或"否"的检测可以脱离反应动力学的限制，可以通过对反应终点的判断，得到定量的信息，并且数字化检测技术还可以显着提高对反应条件检测的灵敏度.

　　3结语

　　基于微流控芯片技术的2个领域，即对切换系统的研究和对单一的生物实体的研究，实际上并没有清晰的划分，有很多实例是跨领域的，作为其技术基础的微流控芯片技术也是共享的。基于微流控芯片技术的这2个领域的最新进展反过来也在促进微流控芯片技术的成熟，出现了芯片实验室等一系列微分析系统.

　　在未来，随着微流控芯片技术和数字的生物化学互相促进和发展，数字化的研究领域会更广泛并更深入.如果未来能有更有效的信号放大技术，数字的生物化学能够普遍实现单分子的检测和分析；在化学反应网络研究中，数字化生物化学技术能够大大提高检测能力，提高研究效率.在某些研究具有高度异质性的生物实体的领域，如哺乳动物免疫系统和DNA、RNA序列和功能等，数字化生物化学有很强的适应性.

　　基于数字化生物化学的分析手段有小型化和耐用性好的优势，这些优势使其能在未来的商业化应用中大显身手，有可能推动生物农业技术、临床检测技术等进入应用末端，并产生巨大的经济和社会效益。