抗肿瘤抗体工程技术的最新研究进展

　　肿瘤生物治疗是继手术、放疗、化疗外的另一种肿瘤治疗模式，近年来发展很快，它主要包括：细胞因子治疗、免疫细胞治疗、基因治疗和抗体治疗等，特别是抗体作为直接的治疗药物广泛用于肿瘤的临床治疗。至 2014 年美国 FDA 已经批准 40 个抗体药物上市，其中 19 个用于肿瘤治疗。肿瘤的生物治疗除了将抗体直接作为药物应用外，也可以与一些细胞因子联合在体外处理从患者体内采集的免疫细胞，然后通过体外培养和扩增后再回输到患者体内，以激发和增强机体自身免疫功能，从而达到治疗癌症的目的。

　　CD3 AK 疗法就是其中的一种，它是抗 CD3 单克隆抗体和白介素-2（IL-2）共同激活的杀伤细胞，该细胞具有扩增能力强、体外存活时间较长、细胞毒活性高、分泌淋巴因子能力强等优点，但这些疗法仍处在研究阶段，需要临床试验进一步证明其疗效。目前肿瘤的生物治疗仍以抗体药物为主，其单独应用或与放疗、化疗药物等联合应用可以消灭残留病灶，防止转移、复发，提高治愈率。2014 年全世界药品销售额前十位的药品中抗体药物就占 5 个（其中 3 个用于治疗肿瘤），抗体药物的迅猛发展得益于抗体工程技术的进步，本文重点介绍抗肿瘤抗体工程技术的最新研究进展。

　　1 抗体人源化和人源抗体制备技术的进步

　　最早出现的人源化抗体是人 - 鼠嵌合抗体，由鼠抗体可变区基因片段连接到人抗体恒定区基因上获得。一般嵌合抗体的人源化程度可达 70%,大大降低了鼠抗体的免疫原性，例如美国 FDA 批准的ReoPro,Rituxan,Remicade,Simulect,Synagis 和 Er-bitux.嵌合抗体在临床应用中已被证明是安全的，但不能完全消除人抗鼠反应（HAMA）。

　　抗体进一步人源化的方法很多，最早是 CDR 移植，将鼠抗体的 CDR 移植到人抗体的相应部位，这样人源化程度可达 90% 以上。另一种常用的人源化方法是表面重塑技术，即鼠抗体框架区表面氨基酸的“人源化”.以后 Dall'Acgua[1]提出框架改组（framework shuffling）的方法进行抗体人源化改造，这种抗体接近于天然的全人抗体。如果抗原有晶体结构，则可以采用特异性决定基（specificity determi-ning residues,SDR）移植[2]的方法，将这些决定抗体特异性的关键氨基酸移植到相匹配的人抗体相应位置上。

　　去免疫原性是另一项专门的平台技术，包括确定和去除鼠抗体上能被人 T 细胞识别的表位，这样的治疗性抗体不再激活 T 细胞反应和以后的 HAMA反应。迄今为止，经不同人源化方法改造的上市抗体有：Zenapax、Herceptin、Campath、Xolair、Raptiva、Avastin、Tysabri、Actemra、Soliris 等。

　　上世纪九十年代，抗体库技术的出现为抗体人源化和人源抗体的制备开辟了新途径。该技术在体外模拟了抗体的体内成熟过程，从 B 淋巴细胞中扩增全套抗体的轻链和重链基因，克隆到特定载体上，使抗体展示于噬菌体表面，构成噬菌体抗体库，用抗原筛选出表达相应抗体的噬菌体，经扩增、测序可获得特异性抗体基因。如果 B 细胞来源于人外周血，则可得到全人抗体。

　　抗体基因除了展示在噬菌体表面，也可以展示在酵母、细菌、哺乳动物细胞表面和核糖体上[3-6].特别是核糖体展示技术，由于噬菌体抗体库需要通过生物体转化，受转化效率的影响，一般库容不大。而利用 RNA 技术进行的抗体基因核糖体展示不需要通过生物体转化的过程，它完全在体外无细胞体系中进行，从而避免了文库导入细胞所必需的转化步骤带来的转化效率的限制。但从抗体库中获得的抗体往往亲和力不高，需要进行亲和力成熟的改造。用该方法获得的上市抗体有 Humira 等。

　　另一个制备人源抗体的有效方法是利用转基因鼠，该鼠敲除了鼠源免疫球蛋白基因组，而转入人免疫球蛋白基因组，因此，用抗原免疫后可产生高滴度的人抗体，如：Vectibix 等。转基因鼠技术解决了抗体库技术中抗体亲和力不高的问题[7].

　　随着结构生物学、计算生物学、生物信息学、计算机科学的迅速发展，借助已有的抗原/抗体序列、结构信息以及抗原-抗体相互作用模式分析，合理确定功能抗体识别的靶位，进而应用计算机辅助分子设计理论、高通量虚拟筛选技术开展抗体的从头设计成为研究的热点。由于该方法回避了杂交瘤技术、抗体人源化技术、抗体库技术等，必将有着广泛的应用前景。

　　2 提高抗体效应功能的策略

　　治疗性抗体的作用机制有多种，主要可归为 2个基本类型：一类是依赖于它们的抗原结合功能，例如抗体与抗原结合后阻断或中和靶分子的生物学活性、利用抗体的靶向性，将细胞毒性物质导向到靶部位、抗体与细胞膜抗原结合后诱发信号传导的改变，引起细胞凋亡等；另一类除与它们的抗原结合能力有关外，还与抗体的 Fc 结构有关，如：抗体 Fc 与相应细胞上的 Fc 受体结合，可激发抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）和依赖补体的细胞毒效应（CDC），如：Herceptin、Erbitux 通过 ADCC 发挥治疗作用，Rituxan 则通过 CDC 和 ADCC 发挥作用，因此，改进抗体与 FcγRs 或补体的结合，可以提高它们的治疗效果。根据上述作用机制，可针对性地对抗体药物进行改造，提高其效应功能[8].

　　2. 1 改造抗体的 Fc 增加 ADCC 和 CDC 效应

　　改造抗体 Fc 使之提高与 FcγR 的亲和力是改进治疗效果的方法之一。影响 Fc 与 FcγR 结合能力的因素有 2 个，一是 FcγR 上的氨基酸序列，另一个是 Fc 的糖结构模式（glycoform），人 IgG1-Fc 连接的寡糖是双触角复合型的，具有一个核心结构，核心结构中有岩藻糖的抗体其 ADCC 效应差，没有岩藻糖的抗体其 ADCC 效应明显提高，岩藻糖的存在与否不影响抗体与抗原结合及 CDC 效应。因此，提高ADCC 的策略有：（1） 在抗体的 Fc 上进行氨基酸突变，选择 ADCC 效应高的突变体；（2）去除抗体 Fc连接的寡糖上的岩藻糖。2013 年11 月 FDA 批准的罗氏公司的 Gazyva（obinutuzumab,GA101）就是一种低岩藻糖的人源抗 CD20 抗体[9],对于人类弥漫型大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）及套细胞淋巴瘤（MCL）的研究[10]显示该抗体的活性优于美罗华（ritux-imab）.

　　提高 CDC 效应的策略有：（1）突变恒定区的氨基酸，增强其与 C1q 的结合能力，提高 CDC 效应，（2）将人 IgG1 和 IgG3 重链恒定区序列进行 DNA 改组（DNA shuffling），筛选出 CDC 活性高的组合。

　　2. 2 以抗体为导向载体的免疫结合物

　　免疫结合物是以抗体或抗体片段为载体连接放射性核素、药物或毒素构成。这些细胞毒性物质大大增强了抗体杀伤靶细胞的能力。2002 年和 2003年美国 FDA 分别批准在抗 CD20 抗体上连接放射性同位素 Y90和 I131的 Zevalin 和 Bexxar 用于治疗淋巴瘤。抗体交联小分子细胞毒药物也称 ADC（anti-body-drug conjugate）药物，2011 年美国 FDA 批准的Brentuximab vedotin （ Adcetris ） 是抗 CD30 抗体与monometauristatin E 的化学偶联物，治疗霍奇金淋巴瘤和复发性间变性大细胞淋巴瘤。2013 年批准Ado-trastuzumab emtansine （ Kadcyla,T-DM1 ） 是抗Her2 抗体上交联 DM1,治疗乳腺癌[11].ADC 药物的概念很早就提出来了，早期的 ADC 药物由于抗体的特异性差、细胞毒分子的毒性不够强、交联的接头分子不够稳定等原因，在实际应用时效果不理想，2000 年批准的 Mylotarg （ 抗 CD33 抗体上连接 ozo-gamicin 治疗白血病） 因为疗效不明显，毒性较大于2010 年撤市。近年来组成 ADC 药物的抗体、linker和细胞毒分子的研究都有很大进展，表现在：特异性好、免疫原性低且易内化的抗体；在人体血液循环中稳定，不被降解，而到达靶细胞后断裂的 linker,如二硫化交联剂、酸敏感和肽酶敏感的交联剂等；以及细胞毒性极高的药物分子，如刺孢霉素、美登素、甲基奥利他汀 E 等，在一个抗体分子上只要交联 3 或 4个细胞毒分子就足以杀死靶细胞。目前 ADC 药物发展渐趋成熟，成为世界各大制药公司进行抗体药物研发的热点之一。

　　2. 3 双特异性抗体

　　大部分疾病都涉及多个靶点或多种信号通路，因此，双特异性或多特异性抗体就可以同时与两种以上抗原发生反应，并使之交联，因此，双特异性抗体可更好地行使效应分子的功能，目前双特异性抗体从作用机制上可分为双重信号阻断型和抗 CD3+T 细胞介导的双特异性抗体；从结构上可分为由单链抗体或 Fab 区组成的小型抗体和全抗体，如：BiTE（bispecific T-cell engager）、DVD （ dual-variable do-main）；从制备上可分为单细胞内表达和双细胞系表达结合体外装配等方式。2009 年欧盟批准双特异性抗体 catumaxomab 上市，治疗癌性腹水，该抗体同时针对肿瘤细胞上的上皮细胞粘附分子（EPCAM）及淋巴细胞上的 CD3 分子。2014 年美国 FDA 批准的 Blincyto 是抗 CD19 和 CD3 的 BiTE 型双特异性抗体，它们可以通过激活 T 细胞来杀死肿瘤细胞[12-13].

　　提高抗体效应功能的方法有很多，在进行抗体改造的时候，应该有目的地选择合适的方法进行。

　　3 新靶点抗体

　　肿瘤免疫治疗是一种通过激活人体自身免疫系统来对抗肿瘤的治疗方法，在了解抗肿瘤免疫的产生和调节机制后，提示至少在几个阶段可以进行治疗性干预，其中克服肿瘤部位的免疫抑制尤为重要，因此，除了直接针对肿瘤的靶点外，将人体自身免疫系统的抑制分子作为靶点，特别是针对免疫检查点的抗体在肿瘤治疗中取得显著成绩，例如：2011 年美国 FDA 批准的抗 CTLA-4 全人抗体 Ipilimumab 不仅在黑素瘤，而且在肾癌和肺癌患者中均取得令人惊喜的疗效，另一个免疫检查点分子 PD1 的阻断抗体 Nivolumab 和 Pembrolizumab 于 2014 年被批准上市，治疗晚期黑素瘤，显示较好疗效。其它适应症，如非小细胞肺癌正在进行临床试验[14].MEDI4736和 MPDL3280A 是两个靶向 PD1 配体 PD-L1 的抗体，目前正在进行治疗非小细胞肺癌的Ⅲ期临床试验。其它可以作为新靶点的免疫检查点分子有：LAG3（淋巴细胞活化基因 3 蛋白），KIR（ 杀伤细胞免疫球蛋白样受体），IDO1（吲哚胺 2,3-双加氧酶1），4-1BB （ 肿瘤坏死因子受体超家族成员 9 ） 和OX40（肿瘤坏死因子受体超家族成员 4）。

　　4 展 望

　　作为治疗制剂，抗体最早用于病原微生物感染引发的疾病治疗。随着基因工程技术趋于成熟，抗体研发进入了新的阶段。今后几年抗肿瘤抗体药物的发展趋向：（1）抗体上连接细胞毒性分子，即 ADC药物； （2）敲除抗体 Fc 上的岩藻糖，增加 ADCC 效应；（3）利用免疫系统上的靶分子制备双特异性抗体等。