摘 要 随着固定化酶技术的日新月异，微胶囊技术得到了长足的发展。与传统微胶囊生产技术不同，文章介绍了一种“天然的”微胶囊固定化酶生产新技术---酿酒酵母孢子微胶囊固定化酶技术，详述了该固定化技术原理及实例。该技术优点在于： 固定化酶的组装“自然”完成，具有天然抗逆性，大小均一，可重复使用，绿色环保，可实现多种酶的共同固定。最后，对其应用前景进行了展望。
关键词 固定化酶； 微胶囊技术； 酿酒酵母孢子固定化酶； “一孢多酶”法。
固定化酶技术已成为酶工程研究的重点和热点之一。与游离酶相比，固定化酶提高了酶的稳定性，并使酶能够反复回收利用。微胶囊技术推动了固定化酶的广泛应用。微胶囊固定化酶采用高分子材料将酶包裹在介质周围形成微小颗粒，被包裹的物质称为囊心或芯材，壁壳称为囊壁或壁材[1].微胶囊固定化酶能够提供一种特定的反应微环境，使反应物或产物选择性进入或释出[2].微胶囊固定化酶最大的特色在于其能将囊内和囊外空间隔离，提高了酶的稳定性，并且可对囊内外的物理化学性质进行有效调控。如今该技术已广泛应用于食品、医药、化妆品、化工、纺织、生物、农业等领域[3].然而传统的微胶囊固定化酶技术不足之处在于： 纯酶和载体的准备以及对组装设备的依赖增加了生产成本，尤其是对产量要求不大，但仍需要昂贵设备进行加工的酶微胶囊，其成本更高； 微胶囊颗粒均一性欠佳，产品性能差异较大[4]; 固定化过程产生有害物质[5],给人身安全、环境等带来隐患； 等等。因而研究探索新的酶固定化技术，开发稳定、高效、生产便利的生产方式，改善微胶囊固定化酶产品性能、降低生产成本、减少生产过程中的资源消耗和环境污染等，是微胶囊固定化酶技术的主要研究内容，符合当今工业绿色环保、可持续发展的要求[6 -7].
对于酿酒酵母孢子的研究很早之前就有报道，但是将孢子应用于酶的固定化却鲜有报道。近些年来，随着对酿酒酵母孢子的深入研究[8 -9],孢子的应用领域逐步得到拓宽，酿酒酵母孢子微胶囊固定化酶（ Saccharomyces cerevisiae spore microencapsulated en-zyme） 技术应运而生。该技术是利用基因工程技术，将可溶性分泌蛋白（ 即目标酶类） 基因在孢子中进行表达，在产孢过程中实现对该蛋白的微胶囊固定化。该技术生产平台仅需发酵设备，生产规模可根据产品需求量灵活调节。基于对酿酒酵母孢子壁结构的研究，本研究室已经成功实现了多种目标酶类的酵母孢子微胶囊固定化[10 -12].本综述对酿酒酵母孢子微胶囊固定化酶（ 以下简称孢子固定化酶） 的原理、孢子的组装过程以及孢子固定化酶的优势进行详细阐述，并对其应用前景进行展望。
酵母孢子固定化酶的方法主要有以下两种： 生物学方法和化学方法。壳聚糖[13]是固定化酶的常用载体，也是野生型酵母孢子壁的重要组成成分，化学方法即通过交联剂将目标酶固定在“壳聚糖球”上，与目前常用的壳聚糖固定化酶操作基本相似； 不同之处首先是利用孢子形成大小均一、性状稳定的天然的“壳聚糖球”,然后将目标酶通过理化处理固定在“壳聚糖球”上。因此，本文对化学法孢子固定化酶的原理不做详细阐述，仅举例说明。生物学方法是通过基因工程技术，将需要表达的可溶性分泌类酶在孢子形成过程中直接固定在孢子壁中，形成天然的孢子固定化酶微胶囊。该技术的重要物质基础是孢子壁中的壳聚糖层和二酪氨酸层。以下，将对孢子固定化酶技术的生物学原理及实例进行详细阐述。
1 酿酒酵母孢子微胶囊固定化酶原理。
酿酒酵母二倍体细胞在营养丰富的条件下通常进行有丝分裂产生子代个体。在受到环境胁迫时，比如氮源缺乏，会迫使酵母营养细胞从有丝分裂进入减数分裂[14 -18],启动产孢程序并最终形成一个含有 4个单倍体细胞的子囊，每个单倍体细胞即为孢子。在产孢过程中，形成了前孢子膜这个特殊的膜结构，胞内的分泌系统通过重构，将可溶性分泌蛋白转运至前孢子膜内； 在前孢子膜内形成孢子壁时，可溶性分泌蛋白被保留在孢子壁内部。虽然，前孢子膜的外膜在孢子壁的组装过程中消失，但是，成熟的孢子壁仍然能够将可溶性分泌蛋白截留固定在壁内，这主要是由于壳聚糖层和二酪氨酸层的存在。SUDA 等[19]在孢子壁完整的野生型酿酒酵母孢子内表达分泌型绿色荧光蛋白 GFP 时发现，其能被固定在孢子壁内； 但是缺少了二酪氨酸层的 dit1Δ 孢子却不能。因此，在孢子中，二酪氨酸层能够阻挡分泌型蛋白的扩散。
酿酒酵母孢子壁包含有四种形态学上不同的结构层次，从内侧到外侧依次为甘露糖层（ Mannan） 、β-葡聚糖层（ β-glucan） 、壳聚糖层（ Chitosan） 和二酪氨酸层（ Dityrosine）[9].这 4 层结构的合成是以从内到外的顺序依次进行的。比如，最外层二酪氨酸层的合成只有在次外层壳聚糖层合成完毕后才开始合成[20].对于壳聚糖层缺失或其合成有严重缺陷的菌株，二酪氨酸层将不能合成。源于孢子壁特有的结构层次，酵母孢子具有高度的抗逆性，比如抗蛋白酶、抗有机试剂、抗热等[21 -22],因此，在孢子将可溶性分泌蛋白固定在孢子壁的同时也将抗逆性赋予了固定在孢子壁内部的蛋白。酵母孢子产孢过程中可溶性蛋白的分泌表达机制及孢子壁的特殊结构层次，尤其是壳聚糖层和二酪氨酸层的存在是实现孢子固定化酶技术的基础； 相比于二酪氨酸层，壳聚糖层对于酶的固定更加必不可少。而酿酒酵母营养细胞细胞壁疏松，结构简单，从内而外依次由 β-葡聚糖层（ β-glu-can） 和甘露糖层（ Mannan） 组成，壳聚糖含量很少，不具备二酪氨酸层，因此对可溶性分泌蛋白的固定比孢子要少很多[10].酿酒酵母孢子壁和营养细胞细胞壁结构如图 1 所示。
酿酒酵母孢子微胶囊固定化酶技术指： 通过分子生物学手段在孢子中表达的可溶性分泌蛋白，在被转运至孢子外部时经过孢子壁，被孢子壁的某些层次所截留： 一部分镶嵌在壳聚糖层中，一部分被截留在葡聚糖层和二酪氨酸层之间的空间中； 随着孢子的成熟，形成了天然、均一、稳定的孢子固定化酶。同时，由于孢子壁最外层二酪氨酸层是网状半透性膜，大分子物质如蛋白质等不能通过，而小分子物质如底物和产物等可以自由通过，底物与固定在孢子壁内部的酶蛋白结合，从而实现孢子固定化酶对底物的酶解。
