孢子固定化酶技术的生物学原理及实例分析(4)

　　在化学法固定化酶的研究中，李毅[50]用缺少了二酪氨酸层的壳聚糖球-dit1Δ 孢子作为固定化载体，对 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行了固定化研究。结果显示，孢子壳聚糖球固定化的 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶展现出较游离酶更广阔的温度和 pH 耐受区间。在重复利用 8 次后，相对酶活仍然高达 80%.最后，又利用一锅两酶法进行了实验： 首先利用osw2Δ 孢子固定的木糖异构酶将 D-葡萄糖转化成 D-果糖，然后利用 dit1Δ 孢子固定的 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶将 D-果糖转化成 D-阿洛酮糖。通过工艺的改进，最终使得阿洛酮糖的转化率达到 12%,比利用游离酶高出 2 倍。至此，利用酵母孢子固定化酶并进行生产已经在实验室水平取得成功。
　　
　　在以上 2 个实例中，研究者均以营养细胞为对照，通过检测带有 RFP 或 GFP 标签的目的蛋白在孢子中的定位，证实了酵母孢子可以将可溶性分泌蛋白表达固定在孢子壁中； 有学者利用酵母营养细胞进行酶的固定化[51],但相对于细胞壁简单的营养型细胞，孢子固定的酶量更多[10].同时，为了比较不同孢子壁缺陷型孢子固定化酶量高低，将带有 3 × HA 标签的目的蛋白在相应孢子中表达。野生型孢子和osw2Δ 孢子表现出相对于 dit1Δ 更高的酶固定量，这与在 dit1Δ 孢子中表达的 MEL1-RFP 或 GFP-XI 融合蛋白荧光信号较弱相一致，说明二酪氨酸层的存在一定程度上阻止了酶的泄漏。二酪氨酸层作为保护屏障，可以保护固定在孢子壁中的酶免受蛋白酶的降解，在研究中也得到了证实[10].之后对固定在孢子壁内部的酶的催化活性进行了确认，并对不同孢子壁缺陷菌株固定化酶的酶学性质进行了研究。总之，以上两个实验从各个方面证明了酵母孢子微胶囊固定化酶的可行性。
　　
　　3. 3 酵母孢子固定化酶的优点。
　　
　　通过酵母孢子固定化原理及已有实验结果可以看出，该方法的优点在于酶的固定化“自然”完成，具有天然抗逆性，大小均一，可重复使用，绿色环保，可实现 1 个孢子对多个酶共同固定：
　　
　　（ 1） 成本低廉： 酵母孢子固定化酶随着孢子的形成而“自然”完成，只要在孢子内部表达所需固定化酶的基因，便可得到孢子固定化酶微胶囊； 无需考虑芯材和壁材的兼容性，避免了对纯酶、固定化材料和组装设备的依赖，降低了生产成本； 不需要理化过程介入，避免了理化处理对产品性能的影响； 生产平台仅需发酵设备，生产规模可根据产量要求灵活调节。
　　
　　（ 2） 抗逆性强： 由于酵母孢子壁的特殊结构层次，其较强的天然抗逆性可以保护固定在其中的酶抵抗外界不利条件的影响。
　　
　　（ 3） 产品质量均一： 酵母产孢为严格的自然生理过程，因此，孢子固定化酶微胶囊大小一致，性状稳定。
　　
　　（ 4） 生产简便： 孢子一经产出无需纯化，便于产品与酶的分离，可重复使用。
　　
　　（ 5） 安全： 酵母产孢过程为自然生理过程，生产过程能耗低、污染少，产品作为生物质可自然降解，绿色环保。
　　
　　（ 6） “一孢多酶”体系初步建立： 笔者已成功将肌酐降解酶系中的 2 种酶共表达、固定在同一孢子内部。实验证实，“一孢两酶”法是可行的，较分别固定后再联合使用表现出更优越的酶学性能。下一步，笔者将对“一孢三酶”法进行研究。
　　
　　“一孢多酶法”是本研究室目前正在进行的酵母孢子固定化酶研究项目之一，目的是实现多酶体系的孢子微胶囊固定化，即在一个孢子内部同时表达、固定两种或两种以上的酶。对于共表达双酶体系的优点，有报道[51 -52]称： 2 种酶的共表达在空间上十分接近，形成的微环境利于第二种酶与第一种酶解产物的迅速结合，节省了第一种酶酶解产物扩散到第二种酶的时间，并为第二种酶解反应提供持续的底物浓度。有学者实现了 D-葡糖异构酶和 D-阿洛酮糖异构酶在大肠杆菌中的共表达[53],且产率达到 16%.在肌酐检测中，肌酐经肌酐酶水解为肌酸，肌酸被肌酸酶水解为肌氨酸和尿素，肌氨酸被肌氨酸氧化酶水解产生双氧水，通过检测双氧水的生成量来确定肌酐的浓度[54 -55].目前，笔者已将“一孢两酶法”成功应用到肌酸酶和肌酐酶在孢子壁中的共表达、固定，这为“一孢多酶法”的研究和肌酐检测试剂盒的研发打下理论基础。届时，酵母孢子对多酶体系的微胶囊固定化将成为另一优势。
　　
　　4 讨论与展望。
　　
　　截止目前，本研究室已经成功地将多种固定在酿酒酵母孢子中，为孢子微胶囊固定化酶的应用奠定了坚实的理论和实践基础。综合考察酵母孢子对不同酶的固定化效果后不难发现： 各突变株孢子中，dit1Δ孢子固定化酶活性最高，但是经反复使用后其酶活下降较快，不宜重复使用； 这是由于 dit1Δ 的孢子壁缺失最外层二酪氨酸层，导致一部分固定不牢固的酶失去扩散屏障而损失，同时抗逆性能减弱。而 osw2Δ 的酶活虽然比 dit1Δ 略低，但其经过反复使用后仍有较高的酶活； 而且，osw2Δ 比 dit1Δ 抗逆性更强，比如经蛋白酶 K、SDS 处理后残留酶活更高，对温度、pH 的耐受性更强； 这是由于该突变株受到二酪氨酸层保护，同时 osw2Δ 孢子壁的二酪氨酸层网孔较野生型松散，增加了底物与固定化酶的结合机会。因此，osw2Δ 孢子是比较理想的固定化酶载体。因此，通过调节二酪氨酸层孔径大小，开发固定化酶性能优于osw2Δ 的酵母孢子突变株是该研究的下一个目标。
　　
　　目前，本研究室利用酵母孢子固定化技术正在进行的研究项目有： 肌酸酶和肌酐酶的固定化，以期开发肌酐检测用试剂盒； 固定化稀有糖酶，用于功能性稀有糖的生产； 其他研究项目，如肠胃道给药载体的研究。虽然人的肠胃道环境和果蝇不同，但是孢子的抗逆性使其可以穿过果蝇肠胃道[56],这为利用孢子的强抗逆性开发一般药物难以到达的肠胃道中末端药物提供了思路。因此，将孢子微胶囊固定化酶用于药用试剂盒和功能性药物的研发具有极大的潜力。