RNA的提取技术与RNase的污染防治

　　RNA 的提取技术是现代分子生物学中最常用的操作技术之一。不同组织中总 RNA 的提取实质上就是将组织细胞裂解，从而释放 RNA,在进一步的研究中，我们高度依赖所提取的总 RNA 的质量。RNA 样品易受环境因素特别是 RNase 的影响而降解[2],提取 RNA 的过程中，只要存在少量的RNase 就会引起 RNA 降解。故在实验中应严格控制各个影响因素、防止 RNase 的污染，是提取高质量 RNA 样品的关键。

　　1 组织质量的影响

　　组织样本质量是 RNA 提取实验成功与否的重要因素之一。我们的实验是小鼠肿瘤组织总 RNA的提取，基本所有组织和细胞都含有内源性 RNase,为了防止总 RNA 的降解，使用液氮来速冻组织，在研磨组织的过程中，我们使用研钵加液氮研磨法进行研磨[3].即研磨过程中将组织放入研钵后，加入液氮研磨并及时添加液氮，确保肿瘤组织能够一直浸在液氮中，防止 RNA 降解，保证 RNA 的质量。

　　2 实验器具的影响

　　由于 RNA 本身不稳定，加之 RNase 的普遍存在，使得分离完整的 RNA 分子更为困难[4].在RNA 提取过程中最主要是防止外源性 RNase 的污染，首先是要保证整个实验在超净工作台中完成； 其次是对实验器具进行处理，主要有以下几点： （ 1） 研磨过程使用的研钵需要高温干燥处理后使用； （ 2）实验中使用的 EP 管，枪头等塑料制品，需要用DEPC 水[1]浸泡 24h 后，经高温灭菌干燥后使用；（ 3） 为了防止 RNase 的污染，用 DEPC 水替代三蒸水进行溶液的配制； （ 4） RNA 操作中使用专用的器械，有条件的也可以设置专用实验室。

　　3 实验人员的影响

　　实验人员对整个实验的影响，主要是外源性RNase 的影响。外源性的 RNase 是无处不在的，它很容易污染实验中的各种器材、实验用品和实验试剂等； 实际操作过程中，手套是最容易污染样品的，因此手套要勤换； 实验操作人员说话过程中所带的唾液中也会携带 RNase,会导致样品的降解，故需带口罩操作； 在 RNA 整个提取过程中，实验人员熟练快速的完成整个 RNA 的提取，减少实验所用的时间，也可有效减少外源性 RNase 污染的几率。

　　4 实验试剂的影响

　　RNA 提取的过程中，每一步所用试剂的量，以及所用的时间都会影响 RNA 的完整性、含量及纯度。

　　4. 1 Trizol 试剂

　　Trizol 试剂是即用型细胞和组织总 RNA 提取试剂，可直接从组织或细胞中提取总 RNA,能迅速裂解细胞，并抑制细胞释放出来的核酸酶； 使用 Trizol试剂时，1mL Trizol 最多裂解 100mg 的组织，而在实际实验中，我们发现 100mg 的组织使用 1. 2mL Tr-izol 裂解，可以获得更满意的结果。

　　4. 2 氯仿

　　氯仿也叫三氯甲烷，是一种有机物 - 烃的衍生物，在光照下遇空气会逐渐被氧化并生成剧毒的光气，因此需要存放在密封的棕色瓶中； 氯仿分离是RNA 提取实验关键步骤之一，匀浆后的组织液中加入氯仿，震荡离心后，RNA 会溶解在上层的水相中，转移 RNA 到新管的过程中，采用小枪头少量多次吸取，可防止误吸下层杂质[6].

　　4. 3 异丙醇和乙醇

　　RNA 和某些杂质不溶于异丙醇，故异丙醇具有沉淀 RNA 的作用，RNA 沉于管底后，用 75% 的乙醇对沉淀进行清洗，乙醇可洗去沉淀中可能的有机物杂质和残留的异丙醇。但由于醇类可以抑制核酸的反应，因此在弃乙醇后晾干的步骤是至关重要的，在这里不可以用加热或离心的方式使 RNA 干燥，否则会出现 RNA 样品很难溶解的现象。

　　5 RNA 浓度的测定

　　在 RNA 提取之后，我们使用 DU800 紫外分光光度计测 OD 值来定量 RNA 的浓度。在测定 OD 值时，每一个样品测定前都需要用 DEPC 水进行仪器校正，测定后用蒸馏水彻底清洗比色杯，从而避免样品之间交叉污染，影响结果。

　　6 RNA 的保存

　　由于 RNase 广泛存在，提取后的总 RNA 中常常会存在少量的 RNase,随着保存时间的延长，极易出现 RNA 降解的情况； 实验中一旦出现大量的 RNA降解，会直接导致后续实验无法顺利进行。cDNA可反映 RNA 的性状，而且 cDNA 的稳定性较好。因此，提取后的 RNA 经过检测纯度和浓度合格后，应尽快进行后续实验或取部分 RNA 提取物及时逆转录成 cDNA 保存，以保证后续实验的顺利进行。

　　7 结语

　　RNA 质量的好坏会直接影响后续实验，提取高质量 RNA 是后期实验的前提和基础。因此，熟练的掌握 RNA 提取的基本原理、注意事项和各种影响因素，对实验的成功与否至关重要。以上是笔者总结的一些经验，在实验过程中遇到具体的问题，还需要根据实际情况进行不断的改进和完善，从而使实验能够顺利完成。

　　参考文献：

　　[1]王桂玲，黄东阳，刘戈飞。 一种从动物组织中提取高质量总RNA 的方法[J]. 生命科学研究，2003,7（ 3） : 275-278

　　[2]Barbas A,Matos RG,Amblar M,et al. New insights into the mech-anism of RNA degradation by ribonuclease II: identification of theresidue responsible for setting the RNase II end product [J] . J BioIChem,2008,283: 13070-13076

　　[3]张宏山，许明，张阳，等。 小鼠心肌组织 3 种总 RNA 提取方法比较[J]. 临床心血管病杂志，2010,（ 2） : 149-150

　　[4]（ 美） R. E. 法雷尔。 RNA 分离与鉴定实验指南： RNA 研究方法（ 原着第 3 版） . 北京： 化学工业出版社，2008,26-27

　　[5]王长晔。 RNA 提取过程中 DEPC 的毒性[J]. 创新技术，2008,（ 5） : 5-6

　　[6]戴先成，柴智锋，徐永城，等。 Trizol 法大鼠心肌总 RNA 提取方法探讨[J]. 刑事技术，2014,（ 3） : 15-16