高频电刺激下丘脑后核后大鼠僵直和运动能力变化

　　前言

　　帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种中老年人常见的中枢神经系统退行性疾病，以震颤、僵直、运动迟缓和姿势平衡障碍为主要特征。脑深部刺激（deep brain stimulation, DBS）被认为是目前治疗帕金森病的最佳方法，根据不同的症状选择相应地靶点，其中常用的刺激靶点有丘脑底核（subthalamic nu-cleus, STN），苍白球内侧部（globus pallidus internal, GPi）和丘脑腹中间核（Vim）。然而，这些靶点对于帕金森病的运动不能（akinesia）均效果欠佳。下丘脑后核（posterior hypothalamicnucleus, PH）与运动皮层、丘脑、小脑、间脑以及脊髓存在广泛的纤维联系，在行为的组织过程中具有重要作用。有实验表明损毁下丘脑后核可导致动物运动不能。本实验利用氟哌啶醇致僵直大鼠模拟帕金森病的运动不能，通过高频电刺激下丘脑后核（PH），观察大鼠僵直和运动能力的变化，探索 PH 在帕金森病中的作用，从而探讨 PH 在 DBS 治疗 PD 的中潜在的应用价值，拓宽现有的 DBS 刺激靶点，为临床应用提供实验依据。

　　1、 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　健康成年 Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠 24 只购于第四军医大学实验动物中心，体重 280 g±20 g。安静环境饲养，室温 22±1 ℃，人工昼夜节律（12 h/12 h），自由取食饮水。

　　1.2 实验分组及给药途径

　　将大鼠完全随机分为 3 组，每组 8 只，即对照组（给予等体积生理盐水），假刺激组（给予 1 mg/kg 氟哌啶醇,PH 置入电极不刺激），刺激组（给予 1 mg/kg 氟哌啶醇，PH 130 Hz，波宽 60μs，强度 100 μA 的高频电刺激）。每组按大鼠每公斤体重 2 mL腹腔注射给予生理盐水或氟哌啶醇。

　　1.3 主要试剂与仪器

　　氟哌啶醇（美国 Sigma），克紫（美国 Sigma），氨苄青霉素（哈药集团），水合氯醛（上海山浦化工），玻璃离子体水门汀（上海青浦尼康齿科器械厂），立体定向仪（深圳瑞沃德 68025），微型电动颅钻（深圳瑞沃德），跑步机（美国 Panlab LE8706），双极刺激电极（美国 Rhodes SNEX-100），刺激器（日本 Nihon Kohd-en SEN-3301），冰冻切片机（德国 Leica CM1950）。

　　1.4 PH 电极置入

　　用 7 %水合氯醛成功麻醉大鼠后，以俯卧位将头部定于立体定向仪上，常规去毛发、消毒，切开头皮约 10 mm,剥离皮下组织及骨膜，常规止血，用双氧水清理颅骨表面，清晰暴露前后囟，调整大鼠门齿固定器使前后囟在同一水平面上，参照 Paxi-nos 等大鼠脑立体定位图谱，确定双侧 PH 位置(AP：-3.8 mm，ML:±0.2 mm, DV:-7.6 mm)。用微型电动颅钻钻透颅骨，以注射器针头轻轻将硬脑膜扎破，双侧置入双极刺激电极，其周围置入不锈钢螺丝 4 个，用牙科水泥固定。术后给予肌肉注射青霉素（10 万 U/kg, 2 次 /d）3d 抗感染，单笼饲养，恢复一周。

　　1.5 行为学检测

　　大鼠腹腔给予氟哌啶醇（1 mg/kg）30 min 后，分别利用爬杆试验（bar test）和跑步机试验（treadmill test）评价大鼠的僵直程度和运动能力。爬杆试验：垂直地将大鼠前肢置于一根离实验台 10 cm、水平放置的金属杆上，后肢置于实验台上，记录大鼠保持垂直体位、至少有一前肢在杆上的时间（潜伏期 latency）。

　　潜伏期大于 15 s 认定为僵直，最长潜伏期设定为 180 s。跑步机试验：跑道坡度为 0，电击电流为 0.4 mA,跑步程序为从跑步机最小速度 5 cm/s 开始，依次调速至 10, 15, 20, 30, 50, 70 cm/s，每档速度持续时间为 2 min，随后休息 2 min，直到大鼠累积电击时间超过 30 s,停止试验，比较组间大鼠平均速度和总跑动路程。

　　1.6 电极位置组织学定位

　　行为学检测完毕后，大鼠经水合氯醛深度麻醉，通过双侧PH 刺激电极给予直流电（0.2 mA,10 s） 标记刺激电极尖端位置。常规灌流、固定、脱水，行连续冠状冰冻切片（20 μm），用临时配制地 0.01 %克紫进行尼氏染色（Nissl’s staining），光镜下观察，凡电极尖端不在下丘脑后核范围内的不纳入后续统计分析。

　　1.7 统计方法

　　用 SPSS 17.0 统计软件进行比较分析，潜伏期、平均速度、总跑动距离以 X±S 表示。组间差异采用单因素方差分析，P﹤0.05 为差异具有统计学意义。

　　2、 结果

　　2.1 电极位置组织学定位

　　如图 1 所示，对照大鼠脑立体定向图谱可知刺激电极尖端位于 PH 范围内，电极周围可见胶质细胞浸染呈深染。

　　2.2 PH 刺激对大鼠僵直的影响

　　对照组大鼠均在 5 s 内爬下金属杆，平均潜伏期为（2.63±1.3）s，无僵直。假刺激组和刺激组均产生僵直，其潜伏期分别为（167.88±17.88）、（77.5±21.27）s。3 组间比较差异具有统计学意义（F=212.36，n=8,P=0.000），刺激组潜伏期显著短于假刺激组（P=0.000），仍然长于正常对照组（P=0.000），提示 PH 高频电刺激可部分逆转氟哌啶醇致僵直作用(见图 2)。

　　2.3 PH 刺激对大鼠运动能力的影响。

　　对照组大鼠最大跑动速度可达 70 cm/s，平均跑动速度为(24.55±2.89)cm/s，假刺激组和刺激组平均跑动速度分别为（5.78±0.90）和（12.72±3.66）cm/s，3 组间比较差异具有统计学意义（F=95.75，n=8,P=0.000）。与假刺激组比较，刺激组平均速度显著提高（P=0.000），但仍然低于正常对照组（P=0.000）(见图 3)。相应地，对照组大鼠跑动路程为（189.51±34.17）m，假刺激组和刺激组跑动路程分别为 （8.06±4.35）m 和 （98.61±96.75）m，3 组间比较差异具有统计学意义（F=18.73，n=8,P=0.000）。与假刺激组比较，刺激组跑动路程显著提高（P=0.006），但仍然低于正常对照组（P=0.006）（见图 4）。以上表明大鼠腹腔注射氟哌啶醇后运动能力显著下降，给予 PH 核高频电刺激可部分逆转氟哌啶醇的作用。

　　3、 讨论

　　脑深部刺激（DBS）自应用于帕金森病治疗以来，因其非破坏性、可逆性，确切的疗效，较少的副作用和并发症，越来越受到人们的认可，被认为是目前治疗帕金森病的最佳方法。根据患者主要症状的不同选择相应的靶点，如丘脑底核（subthala-mic nucleus, STN），苍白球内侧部（globus pallidus internal, GPi）和丘脑腹中间核（Vim）等。STN 目前被认为是 DBS 的最理想靶点，电刺激 STN 对于震颤和僵直效果最好，对运动缓慢和异动症则效果不佳；GPi 的 DBS 对左旋多巴所致的运动障碍效果最为被肯定，而对于震颤的作用远不如 STN 和 Vim；Vim作为最早应用于临床的 DBS 治疗靶点对于震颤的效果显著。

　　由此可知，单一的靶点刺激往往无法完全缓解所有的症状，每个靶点都具有其局限性，这就有必要寻找更多更好的潜在治疗靶点。

　　目前，对于下丘脑后核（PH）的功能认识十分有限，从纤维联系上看,PH 与小脑、运动相关的丘脑和皮层，间脑和下丘脑运动相关区域，脑干运动相关区域以及脊髓存在广泛的联系；从神经元性质上来看，PH 绝大部分的神经元为谷氨酸能神经元，其投射为兴奋性投射，这与 STN 神经元较为相似。

　　氟哌啶醇致僵直和运动不能常被用于模拟帕金森病综合征，与脑内立体定向注射 6-OHDA 的帕金森病动物模型相比，该模型具有操作简单、耗时短、运动不能症状明显等优势。爬杆试验的基本原理为让大鼠处于一种难受的姿势，即将大鼠前肢放置于离试验平台 10 cm 高的金属杆上，正常情况下，大鼠将很快做出调整，而腹腔注射氟哌啶醇后，急性阻断脑内黑质纹状体多巴胺能传递使大鼠发生僵直，难以短时间内做出姿势调整。类似地，跑步机试验，是将大鼠置于传输带，被动地活动，一旦活动速度跟不上传输带的速度，将被传输带远端的电栅栏电击，可评价大鼠的运动能力。

　　本研究通过高频电刺激 PH 观察氟哌啶醇致运动不能大鼠运动能力的改变，旨在探索 PH 在帕金森病中的作用，结果显示 PH 高频电刺激可显著逆转氟哌啶醇致大鼠僵直和运动能力下降，提示 PH 是 DBS 治疗帕金森病的潜在靶点。目前DBS 作用机制的研究绝大部分是通过 DBS 刺激 STN、GPi 以及 Vim 进行的。以往对于 DBS 作用机制的解释强调 DBS 对神经元、神经核团的兴奋或抑制作用，当前越来越多的证据表明DBS的作用不仅仅局限于对刺激靶点的兴奋或抑制作用，更多的是对于整个皮层 - 基底节 - 丘脑 - 皮层环路异常活动的调节作用，这也提示可能存在更多的有效刺激靶点，本研究正是对于这一假说的有益探索，拓展了现有的 PD 治疗靶点，有助于 DBS 作用机制的理解。下一步我们将探索 PH 刺激对皮层 - 基底节 - 丘脑 - 皮层环路活动的影响，这将有助于进一步理解高频电刺激 PH 的具体作用机制。