多巴胺胞体树突释放的分子机制

　　1957年，当瑞典人Arvid Carlsson第一次提出多巴胺(Dopamine, DA)可能是脑内的一种内源性神经递质时并没有引起多大的反响，甚至伴随的是讽刺和挖苦。若干年后，Carlsson于2000年斩获了诺贝尔奖，而多巴胺也成为目前研究最为热门的非经典递质。60年前，人们仅仅知道补充多巴胺能够使利血平处理过的动物苏醒，是缓解运动功能障碍的利器。今天，人们则了解到，多巴胺更是维持正常精神活动必不可少的因素，参与到脑活动的各个方面。大量的研究已经清晰地阐明了多巴胺系统在脑内的几条重要环路和调控机制，而由于多巴胺神经元的一些特殊性质和研究手段的匮乏，对于分子水平上，多巴胺神经元究竟是如何将递质释放出胞外的所知仍较局限。随着囊泡释放理论的健全和研究手段的进步，人们也逐渐开始了解多巴胺的释放机制和一些特殊性质。

　　经典的神经递质释放理论认为：神经递质包装在囊泡中并聚集在突触末梢，突触末梢称为活性区(active zone)的特殊结构则集中了囊泡释放和调控的主要部件，在钙离子大量涌入末梢时通过钙离子感受器(主要是Synaptotagmin)触发一系列的分子机器，最终通过SNARE蛋白使囊泡与末梢融合并将神经递质释放到胞外。该理论完美地解释了中枢神经系统绝大多数神经元(主要是Glutamate和 GABA 能等快突触神经元)电信号与化学信号的转换机制并于今年获得了诺贝尔生理学奖。然而，生物学领域从来都是多样和复杂的。脑内的调质系统例如单胺类、神经肽、神经营养蛋白的释放等却并不完全遵循这种经典传递方式，多巴胺就是这类递质的典型代表。多巴胺神经元除了可以在神经末梢释放多巴胺以外，也可以在胞体和树突上释放，即所谓的胞体树突释放。这种释放方式颠覆了传统认为的轴突到树突或轴突到轴突的单向信号传递方向，而是一种树突到树突的双向调控。

　　1、 多巴胺胞体树突释放的发现

　　在网络层面上，多巴胺神经元的神经通路主要有两条，分别是协调运动的黑质(SNc)-纹状体(Striatum)通路和主要影响情绪和高级认知功能的中脑腹侧被盖区(VTA)-边缘系统(limbic system)通路。由于遍布多巴胺神经末梢，纹状体和伏隔核(NAc, nucleus accumbens, 隶属边缘系统)也成为脑内多巴胺浓度最高的区域。在细胞水平上，有别于经典的一对一的突触结构，多巴胺神经元末梢形成直径为0.1~0.5 mm的曲张体。虽然这些末梢也可以形成对称性突触，但由于含多巴胺的囊泡并不在突触周边聚集，而且多巴胺转运体(dopaminetransporter, DAT)往往弥散地分布在末梢，因此提示多巴胺的释放并不局限于突触部位。

　　在多巴胺发现后不久，的确有许多证据提示多巴胺的释放可能不仅仅局限在末梢。首先，随着多巴胺标记手段的进步，人们发现除了多巴胺神经元末梢，多巴胺神经元胞体所聚集的SNc和树突集中的SNr也可以检测到多巴胺的存在。另外，注射3H标记的多巴胺可以在多巴胺神经元胞体和树突上聚集，这说明多巴胺神经元的胞体和树突拥有重摄取多巴胺的功能。最后，局部SNc区注射多巴胺可以抑制多巴胺神经元的电活动，而且这种抑制可以被多巴胺受体拮抗剂所翻转。

　　这提示胞体和树突上存在多巴胺受体。由于SNc区不存在多巴胺神经元末梢，这些受体的存在提示：多巴胺可能来源于其它渠道。胞体树突释放最直接的证据来自于1976年Leslie L. Iversen 实验室所做的多巴胺释放实验。首先他们将仅仅含有树突和胞体的脑片孵育在3H标记的多巴胺溶液中，以此标记多巴胺递质，冲洗后在高钾的刺激下，他们检测到了清晰的多巴胺释放信号，并且这种释放依赖钙离子内流。之后，在体的研究也获得了类似的结果，由此多巴胺神经元的胞体树突释放得以确定。

　　2、 多巴胺胞体树突释放的主要研究手段

　　多巴胺胞体树突释放的研究主要集中于SNc和VTA。而之所以称为胞体树突释放是由于SNc或VTA脑区的胞体和树突交联在一起而无法区分。虽然SNr是多巴胺神经元的树突投射区，但目前几乎没有人将其隔离研究。其次，虽然胞体树突释放在SNc和VTA都发生，大部分的研究仍集中在SNc，主要是因为SNc中没有多巴胺神经元末梢，研究起来比较方便。而VTA则存在自身投射。另外，多巴胺胞体树突释放主要采用的模式生物是豚鼠，而不是大鼠或小鼠，主要原因是采用电化学方法，豚鼠的SNc几乎只有多巴胺可以响应，而大鼠或小鼠中则存在NA或5-HT从而导致信号不纯。对于兴奋性和抑制性神经递质，由于其释放会产生明显的电流反应，可以采用突触后电流的大小来表示释放量的多少。由于多巴胺并不在目标区产生明显的电活动，这种方法也受到局限。目前常用的多巴胺释放的检测手段有以下几种：

　　2.1 同位素标记

　　由于多巴胺神经元本身可以摄取多巴胺，可以采用3H标记的多巴胺来孵育神经元，孵育结束后通过测量灌流液中放射性的强度来衡量多巴胺的释放量。我们上文所提到的证明多巴胺胞体树突释放存在的经典实验即采用这种方法。为降低这种方法的背景噪音，也可以标记多巴胺的前体-酪氨酸，由于酪氨酸羟化酶在特定脑区为多巴胺神经元所独有，由此产生的带有放射性的多巴胺则主要来自多巴胺神经元。另外也可以采用11C标记的受体拮抗剂来进行，这种方式往往用于无损伤的在体实验，即采用PET的方法进行。同位素标记的方法由于灵敏度较高今天仍被大量使用，但主要的缺点是条件要求受限，且时间分辨率很低。

　　2.2 微透析结合高效液相

　　这种方法在微透析探针中通过循环脑脊液在特定脑区采集样品，之后采用HPLC检测。早期由于检测器灵敏度不高，只能采用多巴胺代谢产物如DOPAC、HVA来衡量多巴胺的含量。但由于多巴胺的量与代谢产物关系并不明确，这种方法并不可靠。随着高效液相(HPLC)灵敏度的提高，特别是电化学检测器(ECD)的发展，直接的痕量水平的多巴胺检测成为可能(~25 pg)。采用这种方法可以很容易地同时检测各种递质，并且可以在自由活动的动物上进行。但这种方法的主要缺点仍然是时间分辨率较低，往往一个采样点需要10~30分钟。

　　2.3 伏安法

　　多巴胺的检测也可以采用电化学方法，利用多巴胺容易被氧化的特性，在特定电压(700~1 200mV)下，多巴胺在电极表面发生氧化还原反应，产生电流。目前这种方法主要采用碳纤维电极进行，主要原因是材料稳定并且易于加工。这种方法检测速度很快(~100 Hz)，并且可以检测极小范围内的多巴胺变化。主要的问题是系统不易稳定，碳纤维本身的加工工艺要求较高，另外也并不能够确定被检测物是否为多巴胺，需要其他方法辅助验证。改进的方法是在碳纤维之上再镀一层膜，膜本身只对特定被检测物有通透性，以此来提高检测的特异性，但由于通透效率的影响，这种方式也降低了灵敏度。

　　2.4 光学方法

　　最近，哥伦比亚大学的Sulzer教授等人合成了一系列多巴胺类似物的荧光染料(FFN511, FFN，这种染料可以被囊泡单胺转运体(VMAT2)转运至囊泡内从而可以特异性地标记多巴胺神经元囊泡。通过检测多巴胺神经元的荧光衰减速度来衡量多巴胺释放量。这种方法的主要优点是可以观察单个突触末梢，甚至是单个多巴胺囊泡的释放行为。

　　2.5 检测突触电流

　　由于多巴胺受体中并没有离子型受体，这导致多巴胺释放本身并不能直接引起突触后电流。但事实上，D2受体可以间接激活一种GIRK电流从而引起IPSC。通过检测这种电流也可以衡量多巴胺释放量。这种电流不仅仅能够在同步刺激时记录到，甚至在树突囊泡自发释放时也可以记录到。

　　3、 多巴胺胞体树突释放的分子机制

　　虽然多巴胺能够在胞体和树突释放早已被确定，关于其释放机制的研究却刚刚起步。对于多巴胺胞体释放的分子机制的研究主要集中在以下几个方面：

　　3.1 囊泡的释放和储存

　　一个重要的问题是多巴胺胞体树突释放的形式。有研究指出胞体树突的多巴胺释放可能通过多巴胺转运体的逆转运进行。然而，更多的证据则表明多巴胺在胞体或树突的释放也是以囊泡的形式进行。首先，用肉毒杆菌毒素破坏SNARE复合体可以完全抑制胞体树突的多巴胺释放，说明它们与经典的囊泡释放共享某些通路；其次，囊泡单胺转运体抑制剂可以抑制多巴胺的释放，证明其依赖囊泡单胺转运体的摄取功能。

　　更直接的证据是，胞体上可以记录到明显的量子化事件，这说明多巴胺在释放前已经以一定的形式进行包装。在多巴胺的胞体或者树突部位主要存在两种囊泡：小清亮突触囊泡(SSV)和大致密核心囊泡(LCDV)。由于二者都存在囊泡单胺转运体，一般认为多巴胺在二者中都存在。早期人们认为多巴胺的释放主要来源于大致密核心囊泡中，而近期通过伏安法对囊泡大小的估计以及电镜观察的结果则表明多巴胺主要通过小清亮突触囊泡释放，并且其释放量的大小可以被调节。

　　另外，含有多巴胺的小清亮突触囊泡的释放过程也与快速神经元有所区别。在快速神经元末梢，通常情况下小清亮突触囊泡的释放主要通过囊泡全融合(full collapse)或者形成暂时的融合孔(kissand run)的方式进行。而含有多巴胺的小清亮突触囊泡则拥有更复杂的释放方式，例如在释放位置产生多次的融合口，从而分多次将递质释放出胞外。值得注意的是，虽然多巴胺的胞体树突释放通过囊泡进行，电镜观察的结果却发现胞体和树突上的囊泡数目很少，并不能够满足释放的需要。由于大量的囊泡单胺转运体事实上存在于内质网中(ER)，因此认为：胞体树突释放的多巴胺主要存储在内质网中，在需要时通过生成囊泡释放。

　　3.2 钙离子

　　脑内绝大多数递质的释放高度依赖钙离子内流。与其他神经元末梢释放类似，多巴胺的胞体树突释放也依赖钙离子内流，但胞体树突释放所依赖的钙离子通道也与其它末梢有所不同。末梢多巴胺的释放与快速神经元突触一样，主要依赖N、 P/Q 型离子通道，而胞体树突释放则主要依赖T、O 或者R 型钙离子通道。甚至有一小部分多巴胺神经元并不依赖钙离子通道的激活。另外胞体树突多巴胺释放对钙离子的依赖程度也有所不同。在末梢的多巴胺释放难以维持的钙浓度下(< 0.5 mM)，胞体树突的多巴胺仍可以维持释放。采用电化学方法对多巴胺神经元钙感受器的测试表明，胞体树突释放的EC50只有0.3 mM，而末梢则高达2 mM(37)。这些结果都提示胞体树突多巴胺释放对钙离子的敏感程度更高，也提示胞体树突多巴胺释放可能拥有完全不同的钙离子感受器。与此相应的是： 多巴胺神经元也表达相当数量的内质网APT酶(SERCA)、IP3和RyR受体，这说明多巴胺神经元很容易调动内钙系统。而且电化学的研究表明这些内钙的释放的确可以增强胞体树突多巴胺释放。

　　3.3 多巴胺胞体树突释放的分子机器

　　囊泡的释放不仅仅依赖钙离子内流，更依赖于钙离子所激活的一系列的蛋白，从而触发整个链式反应将囊泡推送出胞外。这其中最为关键的是SNARE复合物和钙离子感受器Synaptotagmin家族。

　　胞体树突多巴胺释放的诸多环节与末梢大不相同，这提示它可能拥有独特的囊泡释放系统。虽然胞体树突多巴胺释放也依赖SNARE复合体，药理学实验也表明： 多巴胺神经元的SNARE对肉毒杆菌毒素B(破坏SNARE复合体中的synaptobrevin组分，可以抑制末梢多巴胺释放)完全不敏感。这说明至少胞体树突释放的SNARE有些特殊。相应的，免疫组化的研究也的确表明多巴胺神经元缺乏常规的synaptobrevin1组分。另一方面，多巴胺神经元并不表达常规神经元中的Synaptotagmin 1和2(钙离子感受器)，而是高表达了钙结合能力更强的Synaptotagmin 7, 这可能与胞体树突多巴胺释放对钙离子比较敏感有关。然而，需要指出的是：

　　尽管多巴胺神经元胞体树突的囊泡释放通路很特别，它还是共享了很多组分，例如syntaxin3、synaptobrevin2和SNAP-25。有意思的是，多巴胺胞体表达了囊泡单胺转运体和质子泵(用于摄取多巴胺进入囊泡)，这与胞体释放相符。但这些蛋白在远端树突却很少见到，这提示树突上的释放可能依赖从胞体转运囊泡，当然也可能存在其他通路，例如前面提到的DAT的反转运。

　　3.4 多巴胺胞体树突释放的调节

　　与其他种类的释放一样，多巴胺的胞体树突释放也受到多方面的调节。一方面多巴胺神经元自身所表达的离子通道、转运体以及受体可以对多巴胺释放产生直接影响；另一方面多巴胺的释放也间接受到很多外部神经投射的调节。

　　自身方面，多巴胺的胞体树突释放可以被局部注射TTX阻断而被去极化增强，说明神经元自身的电活动可以明显影响递质的释放量。多巴胺受体本身对于多巴胺的释放也有不容忽视的调节作用。多巴胺受体特别是D2类受体(主要是D2、D3和D4受体，以D2受体最多)在VTA和SNc脑区胞体和树突具有较高的表达量。D2受体激活可以激活一种钾离子通道，从而降低多巴胺神经元的兴奋性而抑制释放。有证据表明，直接微注射D2受体阻断剂到多巴胺神经元胞体可以增强多巴胺神经元的电活动，说明多巴胺神经元的活动一直处在D2受体的调节下。而另外一个重要的调节因素则是DAT的表达量。DAT是调节多巴胺末梢含量和动力学的重要环节。DAT的表达量在末梢远远高于在胞体和树突上，这就导致胞体和树突释放的多巴胺并不能很快地被清除，从而对多巴胺神经元自身产生更长效的影响。

　　多巴胺神经元的胞体树突释放也受到很多外部递质的影响，其中最为直接的是GABA和Glutamate。在VTA或SNc，有约15%~20%的GABA能神经元存在，多巴胺神经元也接受大量外部GABA能投射，而多巴胺神经元在胞体和树突上也存在GABAA和GABAB受体。功能方面，这些受体的直接激活可以明显抑制多巴胺神经元的放电和多巴胺的释放。而有意思的是，直接局部注射GABAA激动剂muscimol却可以增强多巴胺的胞体树突释放，可能是通过抑制局部的GABA能神经元而作用于局部网络来进行的。多巴胺神经元胞体和树突表达几乎所有种类的谷氨酸受体。

　　直接激活AMPA受体可以明显增加多巴胺释放，而阻断AMPA受体对多巴胺本身的电活动和局部释放却没有明显的作用，但可以抑制多巴胺在mPFC脑区的释放。而与AMPA受体截然不同的是，局部NMDA受体的激活则显著改变多巴胺神经元的放电模式(从单放电变为串放电)并强烈促进多巴胺的释放。

　　4、 多巴胺树突释放的意义

　　目前人们认为多巴胺胞体树突释放的主要生理作用是反馈调节，这又分为两种方式：一种是通过作用于胞体和树突上的D2受体，激活自身的钾离子电流(主要是GIRK通道)从而降低自身的电活动和末梢释放。另外一种则是通过激活局部GABA神经元上的D1受体兴奋这些神经元，从而降低多巴胺神经元向外的投射。这两种调节方式对于多巴胺释放可以达到一种稳态的平衡作用，并可以通过控制胞体树突多巴胺的释放量和不同受体的表达量达到精确地调控。这种调节往往对于维系正常的运动功能具有重要作用。有证据表明，多巴胺胞体树突释放在动物的运动协调中起到重要作用。而一些多巴胺相关的疾病例如帕金森氏病中，运动功能的损伤也不仅仅是由于SNc脑区多巴胺神经元数目的减少，更取决于中脑和纹状体多巴胺的释放以及对释放的调节。由于多巴胺释放的失调往往同时也是多种精神疾病(例如精神分裂症)的主要原因，多巴胺胞体树突释放也可能在其中发挥重要作用。