神经干/祖细胞体外稳定培养研究

　　神经干/祖细胞指的是发展过程在细胞早期阶段的另一种细胞,它含有两阶段神经干细胞和神经祖细胞 .神经干/祖细胞主要分散于纹状体、海马、[ 1 ]室管膜下层等 具有自我增殖、修复及分化为神[3-4],经终末细胞的潜能.从胚胎发育期到成年期的哺乳动物,中枢神经系统内均有神经干/祖细胞的存在[2].虽然这种细胞终生存在,但是由于数量稀少、受局部微环境影响,难以发挥神经修复作用.

　　外源性神经干/祖细胞移植技术在治疗神经损伤性疾病和神经退行性疾病等领域临床实践中的应用价值日益突显.目前亟待解决的问题是:如何成功获得大量性状稳定的人源性神经干/祖细胞供临床治疗研究应用.本研究通过体外稳定培养神经干/祖细胞,使其能迅速达到可观数量且性状稳定,为探究该细胞的生物学特性提供技术支持.
　　
　　1 材料和方法

　　1.1 组织材料

　　取16~20周引产的新鲜胚胎,以水囊引产为好,也可用其它药物引产(利凡诺引产除外),经产妇和家属知情同意并签署知情同意书,经过医院伦理委员会的批准并遵守医学伦理原则.

　　1.2 试剂与设备

　　1%N (Gibco)、10%胎牛血清(Biochromag)的2DMEM/F12(Gibco)、 2%B27(Gibco)、 胰 蛋 白 酶(Amresco)、山羊血清(Jackson)、兔抗Nestin多克隆抗体(CHEMICON)、20ng/ml EGF(Pepro Tech) 、多聚赖氨酸(Sigma)、20ng/ml FGF(Pepro Tech)、TritonX-100(Amresco)、oregon green488 goat anti-rabbitIgG(Invitrogen)、DMEM/F12(Gibco)、倒置显微镜(Olympus)、激光共聚焦显微镜(ZEISS,德国).

　　1.3 组织处理与原代细胞培养

　　将新鲜的人胚胎置于4℃的保温箱中运送,在无菌操作下取出胚胎纹状体区组织,在Hank液中洗去血3液,将所取的组织块切成0.5~1.0cm的小块,用眼科剪反复剪切成糊状,用枪头轻轻吹打3次,保留适量的小组织块.加入10ml的DMEM/F12制成细胞悬液,移至15ml的无菌离心管内,800r/4min离心,弃上清.反复离心2次(800r/4min).最后一次离心弃去上清后加取适量的细胞培养液,用弯头吸管吹打混匀,吸混细2胞悬液至预先用多聚赖氨酸包被过的培养瓶,25cm的培养瓶加液量为4ml,拧紧瓶口,"米"字轻晃培养瓶,使小组织块全部贴壁且相互距离为0.5mm左右为宜.置于37℃及5%二氧化碳培养箱中培养,期间每天观察细胞生长状况,每3~4天半量换液.

　　1.4 细胞传代

　　当细胞长至约90%左右时,用0.25%胰蛋白酶消化1min后,轻轻机械吹打,收集制成细胞悬液,经台盼蓝染色后显微镜下计数活细胞,进行传代,传4 2代细胞的密度为1×10 /cm .

　　1.5 神经干/祖细胞的生长曲线

　　取生长良好接近汇合的细胞,用胰酶消化,制4成细胞悬液后计数.每孔按1×10 /ml传代细胞培养的接种,共接种21孔.3h后开始计数细胞,以后每隔3天计一次,每次取3孔,取平均值,连续计7次.

　　1.6 神经干/祖细胞的冻存

　　配置冻存液:收集需要冻存细胞的上清培养液并用0.22μm滤器过滤去除细胞碎片.冻存液:(胎牛 血 清 ∶ 细 胞 培 养 上 清 液 ∶ 细 胞 培 养 基 ∶DMSO=5∶2∶2 ∶1).调节冻存液中细胞的最终6 7密度为5×10/ml~5×10/ml; 置于4℃ 60min,-20℃70min,-80℃超低温冷冻过夜后置于液氮罐中.

　　1.7 免疫组化化学染色鉴定

　　封闭非特异性结合(含10%羊血清及0.3%TritonX-100的0.01M PBS, 37℃孵育0.5 h).滴加兔源一抗Nestin(1:200),阴性对照不加一抗, 37℃孵育1h,0.01M PBS清洗3次, 5 min/次.两种荧光素标记的二抗按1:400滴加,37℃孵育0.5 h,0.01M PBS清洗3次, 5 min/次,用Bisbenzimide Hoechst 33342染细胞核1 min,0.01M PBS清洗3次,用封片剂封片.最后用激光共聚焦显微镜观察抗体阳性细胞的百分比.每组免疫组织化学反应中,设正常山羊血清代替一抗的实验,无免疫反应呈阳性结果.

　　2 结果

　　2.1 神经干/祖细胞的形态学观察镜下观察可见图1、图2神经干/祖细胞贴壁生长胞体呈梭形或卵圆形,突起细长呈双极和三极,轴突交织成网格.

　　2.2 神经干/祖细胞的生长曲线由神经干/祖细胞生长曲线图可以看出:0~3d细胞增长相对缓慢,3~15d细胞相对较快,15~18d细胞生长相对缓慢处于平台期,18~21d细胞进入衰退期.根据纹状体神经干/祖细胞生长曲线图繁殖最快的是3~9d阶段,其倍增时间约为3~9d(图3).

　　2.3 神经干/祖细胞的复苏和计数细胞存活率取液氮罐内冻存1、3、6个月的细胞分别放入38.5℃水浴锅内并轻轻震荡至剩小冰核为止,并在1min中内完成.拿酒精纱布迅速擦拭瓶盖处.吸出细胞并放入提前备好的缓冲液中离心收集细胞.弃上清液,在培养液重悬细胞.用台盼蓝染色法检测细胞活性为:(87.0±3.08)%.

　　2.4 神经干/祖细胞免疫组织化学染色选取细胞传代培养p3(图4)、p9(图5)、p15(图6)、p21(图7), Nestin免疫组织化学染色鉴定,共聚焦显微镜下可见Nestin阳性细胞率可达85%以上,胞体呈梭形或卵圆形显匀质绿色;胞核另行Hoechst染色呈蓝色.

　　3 讨论

　　由中枢神经系统病变引起的帕金森、老年痴呆、肌萎缩侧索硬化、舞蹈病、多发性硬化和中枢神经系统损伤引起的脊髓损伤、脑卒中等 机体功能下降,是目前临床亟待解决的医学难题.传统的神经医学只能通过手术和药物来缓解维持症状,但不能修复受损的神经细胞来恢复神经功能的完整性.人胚胎神经干/祖细胞的体外培养、储存的成功,为以后的神经系统疾病神经修复奠定了基础.

　　在胚胎发育期和成年期的哺乳动物,其中枢神经系统内都存在具有自我增殖和多向分化潜能的神经干[2]/祖细胞 .神经干/祖细胞有突出的特点:自我更新和多向分化的潜力以及分泌神经营养因子和自我修[7-9]复能力 .目前大量的研究表明,在纹状体区分离[10-11]培养神经干/祖细胞的化学免疫Nestin为阳性 ,因此Nestin被用于在体外实验中培养的神经干/祖细胞的鉴定.大量的基础实验证明EGF、FGF和B27对神经干/祖细胞有相互协同作用,可以更好地模拟人体[10]体液环境,有利于神经干/祖细胞的生长 ,所以被本实验采用.细胞在生长分化期间,会自我分泌一些具有营养及保护细胞的未知因子,有利于更好的超低温存储细胞,提高神经干/祖细胞复苏后的增殖分化能力.目前研究的热点方向是:如何成功获得大量的人胚胎神经干/祖细胞,以供临床研究的应用.由于纹状体区神经干/祖细胞的体外培养生存能力较脆弱,因此在各项操作中都要严格按照制定程序进行操作.

　　取材:应用水囊引产或自然流产等标本来源,但不易选用利凡诺药物来源的标本.根据利凡诺的药理作用及《利凡诺中期引产机制及病理观察》等[8 12]研究表明 :胚胎会吸收大量的利凡诺,利凡诺对细胞膜具有破坏性,并且对胚胎细胞具有渗透性,因此导致细胞坏死,所以排除利凡诺作用来源标本.

　　冻存:纹状体区神经干/祖细胞很脆弱,按传统的冻存方法细胞的存活率不高.因此根据本实验的结果,运用本实验的冻存方法复苏的细胞存活率比传统冻存方法复苏成活率相对较高,且与新鲜细胞的增殖能力差别不大,说明此冻存方法可用于该种细胞的长期保存.

　　操作:该种细胞非常脆弱,特别娇气.体外培养操作的方法与该种细胞的成活率和增殖能力有关,应该相对减少吹打和离心速度、时间、次数.

　　原代培养和传代培养尽量减少不必要的培养板移动,以免影响细胞贴壁的数量.

　　【参考文献】

　　[1] 王 娜, 刘砚星, 连易水, 等. 神经干细胞研究进展[J]. 生物学杂志,2009, 26(1): 55-58
　　[2] Dohthch F, Gaille L, Lim DA. Subventricular zone astrocytes are neuralstemcellsintheadultmammalianbrain[J].Cell,1999,97(6);703-716.
　　[3] Wen T, Li H, Song H, et al. 1Down-regulation of specific geneexpression by doubles trandRNA inducesneural stem celldiffer-entiation in vitro1[J]. Mol Cell Biochem, 2005, 275 (1-2): 215~2211
　　[4] 李秀凤, 管英俊, 于丽. 不同部位来源的神经干细胞的研究进展[J]. 解剖科学进展, 2008, 14(3): 324~327
　　[5] 蔡维望 . 神经干细胞来源及应用的研究进展[J]. 中国生物制品学杂志, 2014, 27 (3): 436-439