牛胎儿脑组织中分离培养神经干细胞(2)

　　3 讨论

　　3.1不同分离方法对牛胎儿NSCs培养的影响

　　从动物脑组织或胚胎神经组织某一区域分离神经干细胞，使用的方法有机械分离法和酶消化分离法[3].对于要从一些纤维成分较少的组织（如脑组织、部分胚胎组织等）中分离神经干细胞来说，机械分离法操作简单，分离过程迅速，对细胞损伤相对较小。另一种方法是酶消化分离法，常运用于成年神经组织中NSCs的分离。本试验以牛胎儿脑组织为研究材料，分别以机械分离法和酶消化分离法对牛胎儿NSCs进行分离培养，发现采用机械分离法获得的原代神经球数量、细胞增殖能力等要好于酶消化分离法。

　　究其原因可能是，酶消化分离法在实际操作过程中很难客观合理地把握酶处理的最佳时间，酶的作用同时受许多因素的影响，而且酶消化处理可能会导致细胞表面受损致使NSCs表面的神经营养因子受体遭到破坏，这些表面神经营养因子受体对维持NSCs未分化状态至关重要。

　　3.2生长因子和血清对牛胎儿NSCs分裂增殖的影响

　　适宜的培养环境和营养条件对NSCs的分裂增殖极其重要。研究表明，生长因子bFGF和EGF对NSCs的分裂增殖及分化起着关键作用，在培养液中添加一定浓度的bFGF和EGF能够使NSCs在体外培养中维持不断增殖而且保持未分化状态[4-5].虽然bFGF和EGF均可促进NSCs的增殖分化，但是2种生长因子对NSCs促增殖作用有差异。

　　bF-GF主要在NSCs增殖的早期阶段发挥作用，而EGF则主要在NSCs增殖后期起作用。另外，bFGF和EGF对NSCs分化的影响也不相同。一般情况下bFGF能最大程度引起干细胞向神经细胞分化，而EGF单独存在下培养的细胞主要形成胶质细胞，神经细胞生成的少[6].一般在NSCs体外培养中，这两种生长因子需要同时添加，这样才能很好地促进NSCs分裂增殖，最大程度抑制其分化。本试验用同时添加有20μg/L bFGF和20μg/L EGF的培养液（无血清）培养NSCs,培养液中形成了大量悬浮状生长的神经球。而在没有添加bFGF和EGF的培养液（无血清）中，我们观察不到悬浮状生长的神经球或者有极少的形态不规则、体积较小的细胞团簇。

　　早期的细胞体外培养一般都添加有血清，大量研究表 明 ,若 用 含 有 血 清 的 培 养 液 培 养NSCs,最 终NSCs在培养的过程会发生分化，这是因为血清中成分比较复杂，其中可能含有一些促分化因子，体外培养过程中这些促分化因子抑制或阻碍了NSCs的增殖。本实验在对NSCs进行诱导分化的过程中，采用的就是添加有血清的培养液。

　　3.3牛NSCs的特性NSCs是具有自我更新能力，高度增殖，并且能分化成神经系统的各类细胞（包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞）的一类多能干细胞。要确定体外分离培养的细胞是否为NSCs,需要从3个方面来鉴定：一是分裂能力；二是多向分化潜能；三是NSCs特异性表面标志物的鉴定。本试验对所形成的神经干细胞球和诱导分化的细胞分别进行Nestin、βⅢ-tubulin和GFAP免疫荧光 鉴 定，结 果 显 示 为 阳 性。 神 经 干 细 胞sox2、Nanog、Oct4和SSEA4等免疫荧光鉴定结果均呈阳性。结果表明，可从牛胎儿脑组织中分离培养NSCs,NSCs具有分化功能。牛NSCs为克隆牛的供体细胞和转基因牛的受体细胞提供了细胞新来源。

　　参考文献：

　　[1]Reynolds B A,Weiss S.Generation of neurons and as-trocytes from isolated cells of the adult mammaliancentral nervous system[J].Science,1992,255:1707-1710.
　　[2] 赵奎，庞全海，王振华，等.羊驼毛束干细胞分离、培养与鉴定[J].中国兽医学报，2014,34（1）:171-176.
　　[3] 顾恩妍，哈福，李林凤，等.神经干细胞分离培养方法的介绍[J].中国比较医学杂志，2008,18:53-57.
　　[4]Reimers D,López-Toledano M,Mason I,et al.Develop-mental expression of fibroblast growth factor（FGF）receptors in neural stem cell progeny.Modulation ofneuronal and glial lineages by basic FGF treatment[J].Neurological Res,2001,23:612-621.
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　　[6]Whittemore S R,Morassutti D J,Walters W M,et al.Mitogen and substrate differentially affect the lineagerestriction of adult rat subventricular zone neural pre-cursor cell populations[J].Exp Cell Res,1999,252:75-95.