神经干细胞自噬途径与机制分析

　　自噬（ autophagy） 作为细胞内物质代谢的重要方式，是亚细胞膜内的结构发生动态变化，也是溶酶体介导细胞内蛋白质和细胞器降解的正常新陈代谢过程。细胞死亡包括坏死、凋亡和自噬三种形式。在细胞平衡合成和分解代谢过程中，通过自噬保持细胞内环境的稳定，使细胞自我更新，保持活力[1-4].自噬不足则细胞衰老，过度则出现程序性细胞死亡（ apoptosis,凋亡） .自噬在维持细胞自身稳定，保护细胞和防止细胞死亡的同时，也在细胞死亡进程中起着重要的作用。

　　自噬过程包括欧米茄体（ omegasome） 形成、自噬体形成、与溶酶体（ lysosome） 融合、底物降解后小分子再利用、自噬性溶酶体（ autolysosome） 再生等步骤[3-5].一般认为，自噬的主要类型包括以下三种： （ 1） 巨自噬（ macroautophagy） ,这是通常所指的自噬，通过形成自噬小体将待降解物质送入溶酶体； （ 2） 微自噬（ microautophagy） ,是待降解物质直接被溶酶体吸收并降解的过程； （ 3） 分子伴侣介导的自噬（ chaperon-mediate autophagy,CMA） ,这种方式降解的蛋白质通常含有分子伴侣识别序列 KFERQ,在细胞质中被分子伴侣蛋白HSC70 识别，被溶酶体膜上的 LAMP2a 和溶酶体内的 HSC73接应，最终进入溶酶体被降解（ Fig. 1）[6,7].

　　神经干细胞（ neural stem cells,NSCs） 是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞，在神经发育和神经损伤过程中发挥重要作用[1,4,8].多种致病的应激状态下，自噬可清除神经细胞内衰老的细胞器和一些异常折叠蛋白等有害物质，有益于神经细胞存活。但若自噬过强也会加速神经细胞死亡[2,4].NSCs 自身移植是修复和代替受损脑组织的有效方法，能重建部分环路和功能，而这一过程离不开神经细胞的自噬[3-5].关于自噬过程中神经细胞信号转导及其对神经细胞生存的影响已进行了大量的研究，利用蛋白质组学方法已确定许多分布广泛且与自噬相关的蛋白，它们在自噬发生过程中和某些细胞信号传导通路密切相关[5,8,9].

　　1 自噬途径
　　
　　1. 1 聚集吞噬（ aggrephagy） 神经细胞利用自噬降解的蛋白质可以组装成大型蛋白质集合体，从而使许多小蛋白质聚合成对细胞毒性更小的物质，这一过程称为聚集吞噬（ ag-grephagy）[5,6].这是泛素-蛋白酶体系统（ UPS） 伴随的促蛋白质降解过程，这些途径既相互交织又存在细微区别。细胞代谢过程可以通过泛素化降解靶向蛋白，而组蛋白去乙酰化酶 6（ HDAC6） 介导的蛋白动力运输，则可伴随连接 Lys63（ K63） 多聚泛素链蛋白质沿着微管优先产生[3,8-10].相反，BAG3 介导的聚集体的形成也使用动力蛋白沿微管运输，却不需要该蛋白质修饰[9].形成聚集体需要 K63 链接多聚泛素以形成自噬受体 SQSTM1,NBR1 和 WDFY3,吞噬泡中的这些受体提供了物理性链接 Atg8,最终形成聚集体被自噬有效降解[5,10].

　　聚集吞噬主要通过巨自噬（ macroautophagy） 方式来完成。巨自噬即通常所说的自噬（ autophagy） ,是一种在生物进化上保持平衡的细胞代谢过程，在保留细胞通道的同时控制蛋白质和细胞器的降解。自噬发生时细胞质和细胞器的一部分进入双膜的囊泡，从而将它们隔离形成自噬小体，随后与溶酶体融合形成密闭的降解物，最终经过一系列蛋白复合物进行有序调控形成自噬体（ autophagosome）[11-13].在这些过程中，与诱导自噬相关的有 ULK1-Atg13- RB1CC1/FIP200C12 或 f44 / Atg101 复合物，与启动自噬体相关的有三型磷脂酰肌醇 3-激酶复合物（ the class III phosphatidylinositol（ PtdIns） 3-kinase complex,包括 Becn1,Atg14/Atg14L/Barkor基因，PIK3R4/VPS15,PIK3C3/VPS34 和 AMBRA1） ,以及与双膜自噬体扩张和闭合相关的有 Atg12-Atg5-Atg16L1 复合物和 MAP1C3A/LC3-磷脂酰乙醇胺（ PE） 复合物[14].哺乳动物自噬体的形成是由 ULK1 复合物（ 包括 ULK1,Atg13,RB1CC1/ FIP200 和 C12 和 f44 / Atg101） 激活诱导，在饥饿状态下由MTOR 复合物 1 （ MTORC1） 抑制，或在低能量状态由 AMPK抑制。一旦激活的 ULK1 复合物易位到内质网的部分，它协同三型磷脂酰肌醇 3-磷酸激酶 （ 包括 PiK3C3,BeCN1,PiK3r4 / p150,AMBrA1,UvrAG,Atg14 和 SH3GLB1） 为自噬体启动并使 Ptdins3P 形成和双 ZFYve1 产生作用。两类泛素系统包括 Atg12-Atg5-Atg16L1 复合体（ 包含 Atg5,Atg7Atg12,Atg10,Atg16L1） 和 LC3-磷脂酰乙醇胺（ Pe） 共轭体系（ 包括Atg3,Atg4,Atg7 和 MAP1LC3） ,共同促进自噬体形成前隔离膜的伸长（ Fig. 2）[14,15].

　　1. 2 异体自噬（ allophagy） 、外自噬（ exophagy） 和异种自噬（ heterophagy） 异体自噬可能涉及分泌自噬（ crinophagy） 和酶自噬（ zymophagy） ,这种自噬来源于父系线粒体的遗传，是一个特征形式的线粒体自噬[6].异体自噬是将细菌等物质运输至溶酶体进行降解，线粒体自噬是降解受损的线粒体。

　　异体自噬中的分泌自噬是含有激素的分泌颗粒[15-17].异体自噬依赖于神经递质调节，在 Atg7 缺陷小鼠背侧纹状体内多巴胺可明显增加异体自噬，这种自噬通过雷帕霉素（ rapa-mycin） 作用，可诱导衰减多巴胺反应，这一过程可能依赖于某些泛素作用[11].对动物酶自噬的研究发现，急性胰腺炎是依赖于液泡膜蛋白 （ VMP1） 和泛素蛋白酶 USP9X,SQSTM1 影响的自噬降解活性酶原蛋白，去除这种潜在有害的活性酶原蛋白可以预防急性胰腺炎的发生发展[18].

　　外自噬不是蛋白的降解，而是蛋白质分泌过程。外自噬的蛋白质分泌有正常分泌和异常分泌两种[19-24].分泌途径通过高尔基体或偶尔直接来自内质网（ ER） .近来，雷帕霉素靶位点（ target of rapamycin,TOR） 作为自噬空间耦合是一个新确定的部位，它负责 IL6 和 IL8 固有分泌。潘氏细胞释放溶菌酶和破骨细胞释放 CTSK /组织蛋白酶 K 就是分泌自噬的例子。

　　ER 和欧米茄体（ omegasome） 分泌促炎因子 IL1β 和在哺乳动物细胞中分泌 HMGB1 则是非常规分泌或自分泌。

　　自噬通常指胞内物质的降解，但异种自噬是一种致力于已经内化的胞外物质的降解过程，与自噬形成鲜明对比。

　　蛋白质被吞噬后，进入早期内涵体及晚期内涵体（ amphi-somes） 和多泡体（ multivesicular bodies,MVBs） 并与溶酶体融合，在这一过程中可以形成胞内微自噬（ endosomal microauto-phagy） .但当细胞内其他代谢和自噬发生协同作用时，早期内涵体和 MVBs 可以融合形成自噬内涵体，反过来又与溶酶体融合[6,21-23].早期内涵体携带的蛋白标志物是早期内涵体抗原 1（ EEA1） ,晚期内涵体的蛋白标志物是磷酸甘露糖受体（ 阳离子依赖性，M6PR） .上述融合事件由 GTP 酶驱动，MVB 自噬体融合依赖于 RAB11,自噬内涵体-溶酶体融合依赖于 RAB7[24-28].胞浆内的蛋白则可通过 HSPA8 介导的胞内小自噬进入 MVBs[23-28].这个过程需要 ESCRT I 和 ESCRTIII 蛋白参与[6,29-32].

　　1. 3 免疫自噬（ immunophagy） 和脂类自噬（ lipophagy） 免疫自噬起到的作用更大、更广泛，包括先天性和后天性免疫性自噬[6,24,33-36].研究表明，免疫自噬被细分为三种类型。I型免疫自噬是外源性或内源性免疫活性分子参与的自噬，主要过程包括细胞自噬激活，模式识别、受体激活、MHC II 级内源性抗原呈现和胸腺选择。II 型免疫自噬调节细胞生存能力和免疫细胞功能，包括 T/B 细胞体内平衡，T 细胞成熟和潘氏（ paneth） 细胞维护。III 型免疫自噬是特定 Atg 蛋白质参与的过程，Atg12-Atg5 RIG-I 类受体信号的抑制和对Atg9 I 型干扰素分泌的 TBK1 信号负调控就是 III 型免疫自噬的例子。

　　脂类自噬可降解脂滴（ LDs） ,调节脂代谢。最终，与溶酶体融合将脂类分解，或将甘油三酯分解成游离脂肪酸，参与自噬的相关蛋白还不清楚[1,25,37-40].除脂类自噬外，胞质脂酶也可将脂类分解生成游离脂肪酸[6,26].肝内特异性Atg7 作用可导致 LD 积累称为肝脂肪变性（ 脂肪肝） .研究表明，小鼠进高脂类食物后肝组织内的游离脂肪酸可以诱导细胞损伤、促使肝细胞自噬活性的升高。抑制自噬可以增强脂肪酸诱导的肝细胞凋亡，而 JNK2 信号通路则在游离脂肪酸诱导肝细胞自噬活性升高过程中发挥一定作用[27].类似的研究表明，脂类自噬是一个信号传感器，在下丘脑细胞调节食欲。减少巨噬细胞脂类分解会导致其过早转换成泡沫5 24神经解剖学杂志， 2015 年 37 月第 31 卷第 4 期细胞，促进动脉粥样硬化发生[16-18].

　　1. 4 线粒体自噬（ mitophagy） 和核自噬（ nucleophagy） 线粒体自噬是线粒体通过自噬的选择性降解，该过程可能在哺乳动物细胞中具有特异性[6-8].例如，网织红细胞线粒体自噬失去线粒体后成为成熟的红细胞，由线粒体 BNIP3L（ BCl2 /腺病毒 E1B 19 kD 蛋白质存在正交互） 介导的交互依赖过程和在恐食症（ phagophores） 患者体内可以检测到 LC3 都与线粒体自噬相关[28].在其他细胞中，PINK1（ PTEN 诱导的激酶1） -PARK2 / 帕金系统似乎也调节线粒体自噬[29].位于损伤线粒体外膜上的 PINK1 协同 E3 泛素连接酶 PARK2 导致K63-泛素化三个已知的哺乳动物蛋白质： 线粒体融合蛋白 1（ Mfn 1） ,线粒体融合蛋白 2（ Mfn 2） 和依赖电压性阴离子选择性通道蛋白1（ VDAC1）[30,31].随后自噬可以通过 SQSTM1和依赖 HDAC6 机制来控制。PARK2 在骨骼肌、大脑、心脏和肝脏中存在丰富，因此其它组织可能使用不同的 E3 泛素连接酶选择性去除线粒体。哺乳动物基因组研究表明，PARK2 介导线粒体自噬，目前的研究表明这一机制的复杂性和不确定性[28].

　　核自噬是在酵母中逐渐进行的细胞核微自噬，部分酵母核膜、核浆凹陷入液泡而分解，但在哺乳动物细胞中可以展示完整的核包埋[32,33].该现象最初在小鼠模型中展现，这是源于核膜相关蛋白的突变，如 LMNA/核纤层蛋白 A（ laminateA） 和 EMD / 伊默菌素（ emerin）[1,6,34-37].已证实从这些突变小鼠分离出的 MEFs（ murine embryonic fibroblasts,鼠胚胎成纤维细胞） 可以降低细胞生存能力和提高核异常，当使用自噬抑制剂时，野生型 MEFs 也表现出核自噬，虽然比突变MEFs 水平低，但这说明核损害发生时的控制机制。拓扑异构酶抑制剂（ 喜树碱，足叶乙甙） ,DNA 嵌入机（ 顺铂） 和氧化应激损伤（ 氧钒根） 均可在癌细胞内诱导核自噬[22-24].

　　1. 5 过氧化物酶体自噬（ pexophagy） 过氧化物酶体是源于内质网分化的一种细胞器。过氧化物酶体自噬是通过过氧化物酶体隔离和降解的选择性自噬过程，以巨自噬或微自噬的形式清除受损的或多余的过氧化物酶体[6,35],其中也包括LON 蛋白酶和 15 -LOX 介导的肿瘤逆转。对肝脏缺乏 Atg7的老鼠资料分析表明，过氧化物酶体自噬有助于 70% ~80%肿瘤逆转，而其余部分与蛋白酶介导机制和 15-LOX 介导的自我分解相关。目前，唯一已知参与哺乳动物过氧化物酶体自噬的过氧物酶体受体是 PEX14,它可以在吞噬泡膜上与LC3 相协同。LC3-RAB7-FYCO1-驱动蛋白复合体负责运输吞噬过氧化物酶体沿微管进入溶酶体。尽管不同的过氧化物酶体膜蛋白的泛素化允许 SQSTM1-介导自噬发生，但确切的这种蛋白目前尚不清楚[36-38].

　　1. 6 内质网自噬（ reticulophagy） 和核糖体自噬（ ribophagy）内质网（ endoplasmic reticulum,ER） 自噬是内质网发生应激反应时的自我降解，外部因素对 UPR（ 未折叠蛋白反应）和 ER-相关降解具有重要的影响，这种作用的触发均由内质网腔中未折叠蛋白聚合体累积所致[39-41].应激导致降低有关物质翻译水平，并通过磷酸 eIF2a 预防额外肽类的产生。

　　此外，EIF2AK3 是位于内质网膜上的常驻蛋白，当分子伴侣从 EIF2AK3 所在的内质网腔解离后，EIF2AK3 被激活，协助蛋白折叠过程，产生二聚化 EIF2AK3,磷酸化 EIF2a,激活ATG12,形成 ATG12-atg5-atg16l1 复合物，触发自噬[6,42].

　　核糖体自噬是细胞质中的游离核糖体的选择性消除过程，与内质网应激反应相关，类似于内织网自噬。建立普肯野细胞神经退行性疾病模型发现，多聚核糖体被分解成未经翻译的单体与自噬体形成相关。但是，介导识别和隔离核糖体及内质网碎片进入自噬体的 Atg 蛋白仍未被确定[41].

　　自噬方式多种多样，可以单一出现，也可以同时出现多种方式，这取决于细胞的内外因素，其结果是细胞合成和分解代谢中维持平衡的细胞内外环境，反之细胞即出现凋亡或死亡。自噬既可抑制也可促进凋亡[6,7-9].

　　2 NSCs 自噬机制

　　NSCs 自噬的发生是机体在应激状态（ 如缺血缺氧等） 下诱导自噬前体形成，逐渐构成自噬体，在这个过程中依赖 At-gl2-Atg5 -Atgl6 复合物，自噬体经由微管运输到溶酶体，二者融合发挥降解底物的作用，这一功能结束后自噬体裂解[6,9,14].自噬的调节与自噬基因及某些蛋白密切相关，其过程包括依赖 mT0R （ marnmalian target of rapamycin） 信号通路的自噬和不依赖 mT0R 信号通路的自噬两种。mT0R 是丝氨酸/苏氨酸激酶，也是氨基酸、ATP、生长因子、胰岛素等的感受器，对细胞生长具有重要的调节作用，对自噬具有门控作用，可以抑制自噬的发生。如 3-甲基腺嘌呤（ 3-MA） 通过抑制 Class Ⅲ Pl3K（ 磷脂酰肌醇-3-激酶） 的活性抑制自噬形成，siRNA 通过降低 Class Ⅲ P13K 活性减少自噬发生，而PTEN 通过水解 Class Ⅲ P13K 产物 P13P 促进自噬的发生发展[1,6].

　　2. 1 自噬对 NSCs 的影响 自噬在神经系统的物质代谢活动中发挥重要作用，特别是在神经细胞处于缺血缺氧、饥饿等应激状态下时，自噬有助于清除细胞内衰老的细胞器和错误折叠蛋白等有害物质，保持细胞活性及自我更新能力[1].

　　研究认为，自噬是许多生物体在饥饿条件下的细胞反应，而基础水平下的自噬作用（ 不依赖营养） 是维持细胞稳态的重要机制，特别是对于有丝分裂后的神经元而言，这也是最早在电子显微镜下观察到的自噬过程，即发现神经元的溶酶体在细胞质中的溶解过程[14,43].泛素蛋白酶体降解过程的研究证明，在一些神经退行性疾病的发生发展过程中，自噬具有重要的保护作用[1,44].

　　缺血缺氧动物模型和细胞培养实验研究证实，自噬可以保护营养缺乏状态下的神经细胞存活，但应用硫化氢或自噬抑制剂 3-甲基腺嘌呤（ 3-methyladenine,3-MA） 则可以明显降低神经细胞的自噬[14,46].抑制体外培养的细胞株自噬则可以增加小脑共济运动失调模型大鼠的神经细胞死亡。也有研究认为，用 3-MA 抑制细胞自噬对神经细胞不具有保护作用，相反还能促进神经细胞死亡。在神经细胞发生和代谢过程中自噬是把双刃剑，依条件不同，自噬可保护细胞，也可促进细胞的死亡[34,46].

　　2. 2 自噬相关基因 NSCs 自噬与一些基因改变密切相关

　　在小鼠 NSCs 分化成嗅球神经的发生过程中的研究表明，Atg5、Atg7、Becn1、Map1lc3a 和 Ambra1 的表达均涉及 NSCs自噬过程[47-49].Ambra1 基因敲除的小鼠自噬基因表达降低，其胚胎发育过程中出现严重的神经管缺陷，表明自噬在神经细胞分化过程中的重要性。敲除小鼠神经细胞的关键自噬基因后，泛素化蛋白聚集体中可出现 Atg7 或 rb1cc1/FIP200 产物的异常积聚，SQSTM1 / p62 折叠蛋白表达异常和线粒体受损，导致细胞凋亡增加，出现神经退行性疾病，这一发现证明自噬是预防神经退行性疾病的保证[14,46,48].

　　关于自噬在神经退行性疾病中的作用的研究已相当广泛，潜在的自噬作用是调节 NSCs 新陈代谢的保证。NSCs 通过自噬把控自我更新和扩增，实现神经元分化和静止的平衡，自噬也必然参与神经发生早期增殖分化为其他神经系的过程。类似造血干细胞（ hematopoietic stem cells,HSCs） 驻留于骨髓一样，NSCs 可以长期保持相对静止并驻留于室下区（ subventricular zone,SVZ） 的侧脑室和成人大脑海马齿状回颗粒下层[47].NSCs 在缺氧的壁龛（ 齿状回的颗粒下区） 中驻留或许是为了维持这些细胞的相对缓慢循环状态以延长循环时间[1,14].NSCs 自噬调节的方式也类似于 HSCs,可以通过 ROS（ reactive oxygen species,活性氧） 水平来控制 NSCs的自我更新[49].研究表明，增加 ROS 是通过 HSCs 静态来减少自噬的，而高浓度 ROS 可升高 NSCs 内源性 ROS 水平，这可以在 SVZ 内的 NSCs 中观察到[48,49].因此，缺氧环境下NSCs 自噬可能是通过调节 ROS 水平和氧化损伤来进行。抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸可拮抗编码转录因子 PRDM16 能够引起的 ROS 水平上升和 NSCs 自我更新的抑制[1,3].但在SVZ 内 ROS 水平存在异质性，提高 ROS 可促进 NSCs 增殖或"激活",而降低 ROS 水平则使其处于静止。假设升高 ROS可以观察到 NSCs 的变化，那么就可以通过敲除某些自噬基因、直接检测 NSCs 的自我更新来确定 NSCs 潜在的复杂调节过程，可以通过 ROS 引起 NSCs 变化的正性和负性调控来证实[7-9].在中枢 ROS 通过调控基因表达对各种疾病和细胞衰老过程发挥制约作用。神经干细胞、造血干细胞和早期祖细胞与它们子代比较 ROS 水平较低，这种差异是维持干细胞正常功能的关键。

　　研究表明在长期缺氧条件下，缺氧诱导因子 1、依赖BNIP3 表达的 α 亚基，如螺旋转录因子 （ helix transcriptionfactor） 、缺氧诱导因子-1α（ HIF1α） 可以促进线粒体自噬（ mi-tophagy） ,调控 ROS 产生过量和 ROS 诱导的细胞死亡[3-5,14].

　　此外，失活的转录因子 FOXO1,FOXO3 和 FOXO4（ 无论是联合还是仅 FOXO3） 均可导致 NSCs 自我更新和分化产生缺陷，而酰半胱氨酸可修复伴有 ROS 增高的这种缺陷。除在NSCs 中的作用外，FOXO1还能够控制癌细胞自噬，而FOXO3 可以调控肌肉细胞自噬[50,51].

　　2. 3 药物对自噬的影响 体外培养的 NSCs / 祖细胞分化为神经元可观察到自噬增加，而3-MA 和渥曼青霉素（ wortman-nin） 明显抑制自噬[4,52-54].此外，体外培养 Ambra1 单倍体缺乏和敲除 Atg5 的嗅球细胞表现为神经元分化降低。

　　神经标记物检测发现用 3-MA 处理鸡胚可显着改变自噬基因的表达，降低听觉神经节的数量，表明鸡耳神经节细胞具有潜在的自噬作用。用丙酮酸甲酯（ methyl tri fluoro pyru-vate,MTFP） 恢复 ATP 水平，可以恢复部分分化缺陷，说明能量供应可影响自噬过程、促进神经元分化[55,56].研究证实，维甲酸可通过抑制 Beclin-1 和 LC3-II 蛋白表达减少小鼠NSCs 自噬，增加细胞凋亡。雷帕霉素联合 MTORC1 抑制自噬可增强 dbcAMP 诱导的 NG108-15 神经母细胞瘤的细胞分化，该过程可被自噬途径抑制剂 3-MA 和去 Becn1 阻止，这为自噬可促进神经细胞分化作用提供进一步证据[57-59].

　　3 展望

　　2014 年，Wang 等[60]首次发现自噬在 Atg5 诱导的 NSCs分化为神经胶质细胞过程中起到至关重要的作用（ Fig. 3） .自噬缺陷的脑发育不正常，胶质细胞分化不完善。Atg5 过表达可以很好地修复自噬缺陷导致的胶质细胞发育异常。同时发现自噬通过吞噬 SOCS2 蛋白影响 JAK/STAT 信号通路，从而最终调控胶质细胞的分化，这对了解自噬在人脑发育中的作用和自噬缺陷导致脑疾病防治等提供重要参考[60].

　　自噬已成为 21 世纪医学分子生物学和神经生物学研究的热点，应激状态下自噬影响和决定神经细胞整个代谢过程，既是神经细胞保护机制，也是神经细胞死亡方式[1,6,9-11].

　　激活神经细胞自噬的内因是基因改变，外因则主要是缺血缺氧[14,61].NSCs 自噬调控机制失调与多种疾病的发生发展和细胞凋亡密切相关。功能复杂的神经网络有赖于 NSCs 分化出复杂多向、功能正常的神经元和神经胶质细胞，因此研究NSCs 分化的调控意义尤为重大[14].NSCs 的自噬与其他体细胞一样，主要是清除降解受损伤的亚细胞结构、衰老的细胞器、以及不再需要的生物大分子等； 自噬物在消化的同时，也为细胞器的构建提供原料； 从而实现细胞结构的再循环。