大籽獐牙菜不同提取部位的抗氧化作用考察

　　近年来的研究表明，氧自由基诱导的脂质过氧化反应与许多疾病的发生有密切的关系，其可引起脂质、核酸、蛋白质、酶等大分子的损伤，抗氧化物质可以减少自由基对生物机体的损伤。

　　抗氧化物质既有化学合成的，也有天然生物物质的提取物。龙胆科（Gentianaceae）獐牙菜属植物（Swertia）中的多种植物在我国民间已有悠久的入药历史，獐牙菜属植物大多含有环烯醚萜、酮类、三萜类和黄酮类化合物，具有清热利胆、消炎、促进免疫、抗肝损伤的作用。本文通过考察大籽獐牙菜不同提取部位的抗氧化作用，以及酮类化合物的抗氧化作用，探讨大籽獐牙菜的抗氧化作用及其机制。

　　1 材 料

　　1.1 药物与试剂：大籽獐牙菜产于西藏。药材粉碎后过 80 目筛，称取 10g，加入 80%乙醇回流提取 3 次，每次 1h，提取液减压浓缩得浸膏，用热水分散后依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，回收溶剂，分别制成石油醚部位（PP）、乙酸乙酯部位（EP）、正丁醇部位（AP）的供试品甲醇溶液（10mg/ml）。

　　肝素钠注射液（2ml:12500Iu，批号 1307113-B），江苏万邦生化医药股份有限公司；总体抗氧化能力（T-AOC）试剂盒（批号：20131221）和丙二醛（MDA）测试盒（批号：20131221）购自南京建成生物工程研究所；牛血清白蛋白 V 标准品 （批号：20131025），上海金穗生物科技有限公司；甲醇、考马斯亮蓝 G-250，无水磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、DL-丙氨酸、α-酮戊二酸、氢氧化钠、丙酮酸钠、2，4-二硝基苯肼、盐酸、氢氧化钾、蒽酮、95%硫酸、葡萄糖等试剂均为国产分析纯。

　　1.2 仪器：Heraeus Multifμge X1 高性能通用台式离心机，ThermoScientific；VIC-412 型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4 数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；XS105 分析天平，梅特勒-托利多；UV-2550 型紫外可见分光光度计，岛津；PB-21 型酸度计，德国赛多利斯；H-1 微型旋涡混合器，上海精科实业有限公司。

　　1.3 动物：家兔，雄性，体重 1.8kg，购自兰州生物制品研究所实验动物中心。

　　2 方 法

　　2.1 大籽獐牙菜不同提取部位对血浆总抗氧化能力（T-AOC）的影响：家兔心脏取血，肝素抗凝，离心分离血浆。取血浆0.1ml，分别加入不同部位供试品甲醇溶液 0.1ml，37℃水浴中温育 30min 后测定 T-AOC，操作方法参照总抗氧化能力试剂盒说明书。每 min 每毫升供试品溶液使反应体系的吸光度值每增加0.01 时，定义为一个总抗氧化能力单位（U）。样品空白以 0.1ml甲醇代替供试品溶液，每个待测液重复做 3 个。

　　2.2 不同浓度大籽獐牙菜乙酸乙酯提取部位对血浆总抗氧化能力的影响：家兔心脏取血，肝素抗凝，离心分离血浆。取血浆0.1ml，分别加入不同浓度大籽獐牙菜 EP 供试品甲醇溶液 0.1ml，37℃水浴中温育 30min 后测定 T-AOC，操作方法参照总抗氧化能力试剂盒说明书。每 min 每毫升供试品溶液使反应体系的吸光度值每增加 0.01 时，定义为一个总抗氧化能力单位（U）。样品空白以 0.1ml 甲醇代替供试品溶液，每个待测液重复做 3 个。

　　2.3 大籽獐牙菜不同提取部位对家兔肝脏自发性脂质过氧化的影响：取家兔肝组织，用冷的生理盐水洗净，滤纸吸干后称重。冰浴下匀浆，用生理盐水制成 10%的悬浮液，2000rpm 离心去除杂质后获得 10%匀浆液。实验分为三组：正常组（10%肝匀浆）；对照组（甲醇）；供试品组（大籽獐牙菜不同提取部位）。首先在各管中加入 10%肝组织匀浆 0.9ml，然后分别加入不同部位供试品甲醇溶液 0.1ml，37℃水浴中温育 120min 后，参照丙二醛（MDA） 试剂盒说明书方法测定，计算脂质过氧化物丙二醛（MDA）的生成量和抑制率（IR）。抑制率（IR）计算公式为：IR（%）=（[正常组测定 OD 值-正常组对照 OD 值）-（供试品组测定 OD 值-供试品组对照 OD 值）]（/正常组测定 OD 值-正常组对照 OD 值）×100%2.4 不同浓度大籽獐牙菜乙酸乙酯提取部位对家兔肝脏自发性脂质过氧化的影响：取上述 10%肝组织匀浆分别置于不同管中，每管各加入 0.9ml，然后依次加入不同浓度大籽獐牙菜乙酸乙酯提取部位甲醇溶液各 0.1ml，37℃水浴中温育 120min 后，参照丙二醛（MDA）试剂盒说明书方法测定，计算脂质过氧化物丙二醛（MDA）的生成量和抑制率（IR）。

　　2.5 酮类化合物对家兔肝脏自发性脂质过氧化的影响：在不同管中分别加入 10%肝组织匀浆各 0.9ml，然后依次加入 80μg/ml 的1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮、1，7，8-三羟基-3-甲氧基酮、1，3，5，8-四羟基酮、1-羟基-3，5，8-三甲氧基酮甲醇溶液各0.1ml，37℃水浴中温育 120min 后，参照丙二醛（MDA）试剂盒说明书方法测定，计算脂质过氧化物丙二醛（MDA）的生成量和抑制率（IR）。

　　2.6 不同浓度 1，3，5，8-四羟基酮对家兔肝脏自发性脂质过氧化的作用：在不同管中分别加入上述 10%肝组织匀浆各 0.9ml，然后依次加入不同浓度 1，3，5，8-四羟基酮甲醇溶液各 0.1ml，37℃水浴中温育 120min 后，参照丙二醛（MDA）试剂盒说明书方法测定，计算脂质过氧化物丙二醛（MDA）的生成量和抑制率（IR）。

　　2.7 统计学方法：实验结果以平均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 11.5 统计学软件作 t 检验，以 P＜0.05 或 P＜0.01 为显着水平，判断各组之间是否存在差异性。

　　3 结 果

　　3.1 大籽獐牙菜不同提取部位对血浆总氧化能力（T-AOC）的作用：大籽獐牙菜各提取部位均可显着提高血浆总抗氧化能力，其中乙酸乙酯部位提高血浆总抗氧化能力的作用最强，其次为石油醚部位，正丁醇部位提高血浆总抗氧化能力的作用最弱（见表 1）。【表1】

　　
　　3.2 不同浓度大籽獐牙菜乙酸乙酯提取部位对血浆总抗氧化能力（T-AOC）的作用：结果显示，大籽獐牙菜乙酸乙酯提取部位低浓度时（2mg/ml）就能产生较好的提高血浆总抗氧化能力的作用（表 2）。其提高血浆总抗氧化能力的作用随着乙酸乙酯部位供试品溶液浓度的增大而增强，呈量效关系（见图 1）。【表2.图1】

　　
　　3.3 大籽獐牙菜不同提取部位对家兔肝脏自发性脂质过氧化的作用：结果显示，大籽獐牙菜各提取部位均可显着抑制家兔肝脏自发性脂质过氧化的发生，其中乙酸乙酯部位抑制脂质过氧化的作用最强，其次为石油醚部位，正丁醇部位抑制脂质过氧化的作用最弱（见表 3）。【表3】

　　
　　3.4 不同浓度大籽獐牙菜乙酸乙酯提取部位对家兔肝脏自发性脂质过氧化的作用：结果显示，大籽獐牙菜乙酸乙酯提取部位低浓度时（2mg/ml）就能产生较好的抗脂质过氧化作用（见表 4）。

　　其抗脂质过氧化作用随着乙酸乙酯部位供试品溶液浓度的增大而增强，呈量效关系，但当浓度高于 6mg/ml 时抑制率随浓度的增大而增强的效果不再明显（见图 2）。【表4.图2】

　　
　　3.5 酮类化合物对家兔肝脏自发性脂质过氧化的作用：结果显示，4 种酮类化合物中有 3 种可显着抑制家兔肝脏自发性脂质过氧化的发生，其中 1，3，5，8-四羟基酮抑制脂质过氧化的作用最强，其次为 1，7，8-三羟基-3-甲氧基酮，1-羟基-3，5，8-三甲氧基酮抑制脂质过氧化的作用最弱，1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮未见有明显的抑制家兔肝脏自发性脂质过氧化的作用（见表 5）。【表5】

　　
　　3.6 不同浓度 1，3，5，8-四羟基酮对家兔肝脏自发性脂质过氧化的作用：结果显示，1，3，5，8-四羟基酮在低浓度时（20μg/ml）没有显着的抗脂质过氧化作用，但当浓度达到 40μg/ml 时能产生显着的抗脂质过氧化作用（见表 6），且其抗脂质过氧化作用随着供试品溶液浓度的增大而增强，呈量效关系（见图 3）。【表6.图3】

　　
　　4 讨 论

　　对大籽獐牙菜提取物提高血浆总抗氧化能力的实验结果表明，其石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位均能提高血浆总抗氧化能力，其中乙酸乙酯部位的作用最强，显着高于另两个部位，并呈量效关系。大籽獐牙菜提取物抗肝脏自发性脂质过氧化的实验结果表明，石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位也都能发挥抗肝脏自发性脂质过氧化的作用，乙酸乙酯部位的作用最强，也呈量效关系。提示大籽獐牙菜抗氧化有效成分多位于乙酸乙酯部位。

　　酮类化合物抗肝脏自发性脂质过氧化作用的实验结果表明具有四个酚羟基的 1，3，5，8-四羟基酮和具有三个酚羟基的1，7，8-三羟基-3-甲氧基酮的活性很强，显着高于另两种，而只含有一个酚羟基的 1-羟基-3，5，8-三甲氧基酮的活性又高于含有两个酚羟基的 1，7-二羟基-3，8-二甲氧基酮。一般认为，含酚羟基的化合物具有明显的抗氧化作用，提示酮类化合物的抗氧化作用可能与酮所含酚羟基的数目及酚羟基所处的取代位置有关。多酚使脂质过氧化自由基猝灭，抑制最终致癌剂与 DNA 共价键结合，提示该类化合物的抗氧化作用与防癌有关。

　　实验表明，大籽獐牙菜提取物具有很强的提高血浆总抗氧化能力及抗肝脏自发性脂质过氧化的作用，同时酮类化合物也具有很强的提高血浆总抗氧化能力及抗肝脏自发性脂质过氧化的作用，这对于大籽獐牙菜的药效学研究及作用机制研究提供了一些理论依据。对新的抗氧化药物及预防恶性肿瘤药物的研发有一定的参考价值。

　　参考文献
　　
　　[1]熊成文，林鹏程.藏药大籽獐牙菜不同提取部位的抗菌活性[J].中国新药杂志，2011，8：740-742.
　　[2]熊成文，林鹏程.藏药大籽獐牙菜的化学成分研究[J].湖南中医药大学学报，2011，5：34-36.
　　[3]熊成文，等.大籽獐牙菜的抗内毒素作用[J].中国新药杂志，2012，7：788-790.
　　[4]梁永欣，等.大籽獐牙菜多糖的提取及含量测定[J].青海大学学报（自然科学版），2006，1：56-58.
　　[5] 张媛媛，等. 大籽獐牙菜化学成分研究 [J]. 中国药学杂志，2007，17：1299-1301.