运用HPLC法测定苦豆草中槐定碱和氧化苦参碱的含量

　　苦豆草为豆科槐属植物苦豆子（Sophora alopecuroides L.）的地上干燥全草，主要分布于我国西北各省区，为一种药用植物，野生资源很丰富，其植物体中含有 20 多种生物碱，以槐定碱、氧化苦参碱等为主，具有清热解毒、祛风燥湿、止痛杀虫，提高机体免疫功能等作用。经药理学研究证明氧化苦参碱抗乙型肝炎病毒效果显着，槐定碱抗肿瘤作用明显，其产品苦参素注射液、苦参素胶囊、槐定碱注射液等已应用于临床。但目前我国尚无苦豆草药材的国家质量标准，本实验在相关研究的基础上，采用 HPLC 法测定了宁夏、青海、甘肃、陕西、内蒙古、新疆六个主产区苦豆草中槐定碱和氧化苦参碱的含量，以期为建立苦豆草药材质量标准提供参考依据。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器：Agilent 1220 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，二元泵，自动进样器，DAD 紫外检测器）；XS105 十万分之一电子天平（Mettler Toledo 设备上海有限公司）；AS3120 超声波清洗器（220V，120W）天津奥德赛恩斯仪器有限公司；FW135 型粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。

　　1.2 试药：槐定碱对照品（批号 110784－200804，供含量测定用），氧化苦参碱对照品（批号 110780－201007，供含量测定用）均购自中国药品生物制品检定所；乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸二氢钾、浓氨水为分析纯，超纯水实验室自制，苦豆草药材分别购于宁夏盐池、青海西宁、甘肃酒泉、陕西定边、内蒙古阿左旗、新疆，经鉴定为苦豆子的地上干燥全草，粉碎后，过二号筛，备用。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件：色谱柱 Agilent TC-C18（2）（250mm×4.6mm，5μm，美国安捷伦公司）；流动相：乙腈—0.05mol·L-1磷酸二氢钾水溶液（三乙胺 2.0ml/L）；梯度洗脱：0～12min，乙腈 6%～10%，12～45min，乙腈 10% ；检测波长：205nm；流速：1.0ml/min；进样量10μL，柱温 30℃。

　　2.2 对照品溶液的制备：精密称取槐定碱、氧化苦参碱对照品适量，置于 10ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，得质量浓度约为 1mg·ml－1的混合对照品溶液，作为储备液。

　　2.3 供试品溶液的制备：取各产地苦豆草细粉各约 0.50g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 30ml 甲醇，1ml 浓氨水，密塞，称定重量，放置室温浸润 12h 后，超声处理 30min，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45μm 微孔滤膜，得供试品溶液。

　　2.4 系统性试验：分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10μL，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图 1。在本色谱条件下，槐定碱、氧化苦参碱和其他生物碱可达到基线分离，分离度均大于 1.5，具有良好的分离效果，理论板数各色谱峰均在 7000 以上，同时空白试验表明无溶剂干扰。【图1】

　　
　　2.5 线性关系考察：精密吸取每毫升含槐定碱 0.804mg、氧化苦参碱 0.808mg 的混合对照品溶液 0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和 3.0ml，置于 10ml 量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀，过0.45μm 微孔滤膜，按“2.1”项下色谱条件依次进样，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，进行线性回归。得槐定碱回归方程 Y=20015.88x-27.95178，r=0.9993；氧化苦参碱回归方程 Y=20059.40x-2.58521，r=0.9998。结果表明，槐定碱在 0.00804mg·ml-1～0.2412mg·ml-1呈良好的线性关系，氧化苦参碱在 0.00808mg·ml-1～0.2424mg·ml-1呈良好的线性关系。

　　2.6 精密度试验：取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样 6 次，进样量 10μL，以混合对照品溶液峰面积进行计算，槐定碱和氧化苦参碱峰面积的 RSD 分别为 0.54%和 0.31%，表明仪器精密度良好。

　　2.7 重复性试验：取同一批次宁夏产苦豆草粉末约 0.50g，平行精密称定 6 份，按“2.3”项下制备，按“2.1”项下色谱条件测定，测得槐定碱和氧化苦参碱峰面积的 RSD 分别为 0.67%和 0.46%。

　　2.8 稳定性试验：取同一批次宁夏产苦豆草供试品溶液，分别在0、2、4、6、8h 进样，结果槐定碱峰面积的 RSD 为 0.61%，氧化苦参碱峰面积的 RSD 为 0.28%，表明供试品溶液在 8h 内稳定，见图 2。【图2】

　　

　　2.9 加样回收率试验：取已测定的苦豆草药材（宁夏产）粉末 6份，每份约 0.25g，精密称定后置于 100ml 具塞锥形瓶中，加浓氨水 1ml、甲醇 30ml，每份样品分别精密加入槐定碱、氧化苦参碱对照品，约与供试品中所含成分量比例为 1∶1，再按“2.3”项下方法操作，制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果平均回收率槐定碱为 99.3%，RSD 为 1.63%；氧化苦参碱为 99.4%，RSD 为 1.82%。

　　2.10 样品测定：取 6 个产地样品，每个产地 3 份，每份约 0.50g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备，进高效液相色谱仪按本文色谱条件测定，以外标法计算样品中槐定碱和氧化苦参碱的含量，结果见表 1。【表1】

　　
　　3 讨 论

　　样品测定选取 6 个产地的苦豆草药材，从两种生物碱总和来看，仅甘肃酒泉产地的含量偏低，其他产地并无显着差别。本实验做了以下分析研究：

　　3.1 流动相选择：以乙腈—0.05mol·L-1磷酸二氢钾水溶液不同梯度洗脱系统进样，结果显示，流动相系统在 0min～12min～45min，乙腈采用 6%～10%～10%的比例洗脱，各生物碱可实现基线良好分离，且分离度大于 1.5。经实验对比发现将 2ml 三乙胺加入0.05mol·L-1磷酸二氢钾水溶液，可使各色谱峰的峰形尖锐、峰形对称。

　　3.2 提取方法选择：选用超声方法提取生物碱可增加生物碱的提取率，缩短提取时间。

　　3.3 提取溶剂选择：苦豆草中的生物碱为弱碱，具有一定的水溶性，通过甲醇、乙醇和纯水溶解样品进样，结果显示，纯水溶解的样品因有水溶性物质，杂峰较多，对色谱峰的分离造成干扰；而甲醇和乙醇溶解的样品其色谱峰的峰形对称性和分离度均较好，但在 205nm 波长处乙醇比甲醇有较多吸收，故选用甲醇作溶剂溶解样品效果最好。

　　参考文献
　　
　　[1]江苏新医学院．中药大辞典[M].上海：上海科技出版社，1986：1293．
　　[2]杨家新，喻志芳.苦豆子的研究进展[J]．天津药学，1998，10（1）：43-46．
　　[3]陈小松，王国俊，蔡雄，等．氧化苦参碱对乙型肝炎病毒转基因小鼠乙肝抗原表达的影响[J]．第二军医大学学报，1999，20（1O）：746-748．
　　[4]李雪梅，李兰珍，陈绍励，等．槐果碱对动物肿瘤的抑制作用[J]．中国药理学报，1984，5（2）：125-130．