驱寒抗感颗粒为纯中药制剂,原处方是北京市密云县中医医院临床验方,后经化裁而成。全方由麻黄、荆芥、苦杏仁、桂枝、甘草等药材组成,具有散寒解表、祛风止咳的功效,主治外感风寒表证。该制剂临床使用后效果良好,且比原汤剂服用量小,服用方便,患者易于接受。为了有效地控制制剂质量,保证药效,经过处方分析,我们采用薄层色谱( TLC) 法对该制剂中的主要药物麻黄、桂枝、苦杏仁进行了定性鉴别,应用高效液相色谱( HPLC) 法对麻黄中的主要有效成分盐酸麻黄碱进行了含量测定,以便建立一种科学准确且操作简便的质量控制标准。
1 材 料
1. 1 仪器 1200 型高效液相色谱仪,美国安捷伦科技公司; AD -2 百万分之一电子天平,美国 PerkinElmer 公司;H66005 超声波清洗器,无锡市超声电子设备厂。
1. 2 药品与试剂 盐酸麻黄碱、桂皮醛、苦杏仁苷对照品,中国食品药品检定研究院,批号分别为: 171241 -201007、110710 - 201016、185361 - 201006; 驱寒抗感颗粒,北京市密云县中医医院制剂室自制,批号: 20120705,20120707,20120709; 水为重蒸水,乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 定性鉴别
2. 1. 1 麻黄的 TLC 鉴别取驱寒抗感颗粒 5 g,研细,加适量浓氨水湿润,再加三氯甲烷 50 mL,加热回流 1 h,滤过,滤液蒸干,残渣加入 1 mL 甲醇使溶解,滤过,取滤液作为供试品溶液; 按驱寒抗感颗粒处方及工艺制备不含麻黄的阴性样品,同法制成缺麻黄阴性对照溶液; 另取盐酸麻黄碱对照品适量,加甲醇制成含量 1 mg/mL 的溶液,作为对照品溶液。照 TCL 法试验,分别吸取上述溶液各5 μL,分别点于同一硅胶 G 薄层板上,以三氯甲烷 - 甲醇- 浓氨试液( 20∶ 5∶ 0. 5) 为展开剂,展开,取出,晾干,喷以茚三酮试液,于 105 ℃加热至斑点显色清晰。结果,供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同的红色斑点; 阴性对照无干扰。麻黄的 TLC 见封 3,图 1。
2. 1. 2 苦杏仁的 TLC 鉴别取驱寒抗感颗粒 5 g,研细,加甲醇 50 mL,加热回流 30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加入 2 mL 甲醇使溶解,滤过,取滤液作为供试品溶液; 按驱寒抗感颗粒处方及工艺制备不含苦杏仁的阴性样品,同法制成缺苦杏仁阴性对照溶液; 另取苦杏仁苷对照品适量,加甲醇制成含量 2 mg/mL 的溶液,作为对照品溶液。
照 TCL 法试验,分别吸取上述溶液各 3 μL,分别点于同一硅胶 G 薄层板上,以三氯甲烷 - 乙酸乙酯 - 甲醇 - 水( 15∶ 40∶22∶ 10) 5 ~ 10 ℃ 放置 12 h 的下层溶液作为展开剂,展开,取出,立即用 0. 8%磷钼酸的 15% 硫酸乙醇溶液浸板,在 105 ℃加热至斑点显色清晰。结果,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点; 阴性对照无干扰。苦杏仁的 TLC 见封 3,图 2。
2. 1. 3 桂枝的 TLC 鉴别取驱寒抗感颗粒 5 g,研细,加乙醇 25 mL,超声( 功率 120 W,频率 40 kHz) 处理25 min,滤过,滤液作为供试品溶液; 按驱寒抗感颗粒处方及工艺制备不含桂枝的阴性样品,同法制成缺桂枝阴性对照溶液; 另 取 桂 皮 醛 对 照 品 适 量,加 乙 醇 制 成 含 量1 μL / mL的溶液,作为对照品溶液。照 TCL 法试验,分别吸取上述供试品和阴性对照溶液各 10 μL,对照品溶液2 μL,分别点于同一硅胶 G 薄层板上,以石油醚 ( 60 ~90 ℃ ) - 乙酸乙酯( 17∶ 3) 为展开剂,展开,取出,晾干,喷以二硝基苯肼乙醇试液。结果,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的橙红色斑点; 阴性对照无干扰。桂枝的 TLC 见封 3,图 3。
2. 2 盐酸麻黄碱的含量测定
2. 2. 1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱: UItimateAQ - C18 色谱柱( 250 mm × 4. 6 mm,5 μm) ; 流动相: 乙腈- 0. 02 mol / L 磷酸二氢钾溶液( 含 0. 2% 三乙胺,磷酸调pH 2. 5) ( 2 ∶ 98) ; 检测波长: 210 nm; 柱温: 35 ℃ ; 流速:
1. 0 mL / min。在此条件下,盐酸麻黄碱能够与其他成分很好的分离,供试品中的盐酸麻黄碱保存时间与对照品相同,并且阴性对照无干扰。见图 4。
2. 2. 2 对照品溶液的制备 精确称取适量盐酸麻黄碱对照品,加入0. 1%盐酸甲醇溶液制成含量 42. 30 μg/mL 的溶液,即得。2. 2. 3 供试品溶液的制备 取驱风抗感颗粒 1 g,研细( 过 5 号筛) ,精确称取 0. 5 g,置于 50 mL 具塞量瓶中,加入 1. 0 mL 浓氨试液,密闭,使之充分湿润,加入氯仿40 mL,超声( 功率 120 W,频率 40 kHz) 处理 20 min,放置至室温,氯仿定容,过滤,弃去初滤液。精确量取 25 mL 续滤液,加入 0. 1%盐酸甲醇溶液 2 mL,摇匀,挥干,残渣加入 0. 1%盐酸甲醇溶液使溶解,移至 5 mL 量瓶中,加入0. 1% 盐酸甲醇溶液定容,离心,分取上清液,即得供试品溶液。
2. 2. 4 阴性对照溶液的制备 按驱寒抗感颗粒处方及工艺制备不含麻黄的阴性样品,再按“2. 2. 3”项下方法制成阴性样品溶液。
2. 2. 5 线性关系考察 取对照品适量,加入 0. 1% 盐酸甲醇 溶 液,分 别 配 成 8. 46、12. 69、21. 15、42. 30、63. 45 μg / mL的盐酸麻黄碱对照品溶液,吸取各对照品溶液 5 μL,按 2. 2. 1 项下色谱条件,依次注入液相色谱仪中进行测定。以峰面积积分值( Y) 为纵坐标,对照品溶液进样量( X) 为横坐标,绘制标准曲线,得到回归方程 Y =2. 155 × 103X + 1. 613( r = 0. 999 9,n = 5) 。结果,盐酸麻黄碱进样量在 0. 042 3 ~0. 317 3 μg 范围内与峰面积积分值有良好线性关系。
2. 2. 6 精密度试验 取同一盐酸麻黄碱对照品适量,按2. 2. 1 项下色谱条件测试,连续进样 6 次,每次 5 μL。结果,盐酸麻黄碱峰面积的相对标准偏差( RSD) =0. 87% ( n= 6) ,表明仪器精密度良好。
2. 2. 7 稳定性试验 取同一供试品溶液适量,在室温下放置 0、2、4、6、12、24 h,按 2. 2. 1 项下色谱条件分别进样5 μL进行测定。结果,RSD = 0. 83% ( n = 6) ,表明供试品溶液在 24 h 内稳定。
2. 2. 8 重复性试验 取同一批号样品适量,按 2. 2. 3 项下方法制成供试品溶液 6 份,按 2. 2. 1 项下色谱条件分别进样 5 μL 进行测定。结果,盐酸麻黄碱含量的 RSD =1. 1% ( n = 6) ,表明方法重复性良好。
2. 2. 9 加样回收试验 精密称取已知盐酸麻黄碱含量( 0. 425 0 mg/g) 的同一批次( 批号: 20120705) 样品 6 份,每份约 0. 5 g,分别精密加入盐酸麻黄碱对照品 0. 120 0、0. 120 0、0. 140 0、0. 140 0、0. 160 0、0. 160 0 mg,按 2. 2. 3项下方法制成供试品溶液,按上述 2. 2. 1 项下色谱条件测定含量,并计算加样回收率。结果见表 1。【表1】
2. 2. 10 样品含量测定 称取 3 批样品适量,按 2. 2. 3 项下方法制成供试品溶液,按2.2. 1 项下色谱条件测定,以峰面积外标法计算盐酸麻黄碱的含量。结果,3 批样品中盐酸麻黄碱的含量分别为0.425 0、0.417 4、0.409 8 mg/g。
3 讨 论
在驱寒抗感颗粒组方中麻黄、苦杏仁、桂枝均为主药,因此对其进行了定性鉴别,且麻黄为君药,对其有效成分盐酸麻黄碱的研究较多,检测方法成熟准确,故对其进行了 HPLC 含量测定。在对麻黄、苦杏仁、桂枝的定性鉴别中,按2010 版《中华人民共和国药典》即可取得良好结果。
对盐酸麻黄碱的定量鉴别,我们在参考文献方法的基础上,分别用 1. 44%磷酸溶液、氯仿和碱性甲醇作为提取溶剂,发现氯仿的提取率最高且峰形理想。经方法学考察表明,本方法操作简便,准确性、可靠性、重复性好,可作为驱寒抗感颗粒的质量控制标准。
参考文献
[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 2010 年版( 一部)[S]. 北京: 中国医药科技出版社,2010: 300,187,259.
[2] 刘睿,王宁,刘志辉. RP - HPLC 同时测定宣肺止咳口服液中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱及苦杏仁苷含量[J]. 中国实验方剂学杂志,2011,17( 16) : 91 -93.
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