降低粒径对雄黄的抑瘤活性提升作用分析

　　雄黄在医学上的应用，最早记载见于《神农本草经》，具有解毒、杀虫、燥湿、祛痰、截疟的功效。《中国药典》记载：雄黄，辛温有毒，入肝胃经；具有解毒杀虫、化痰消积、燥湿祛风的功效，内服每次０．５～２．０ｇ，外用适量［１］。２０世纪８０年代，有人以含雄黄的方剂治疗慢性粒细胞白血病，取得一定疗效［２］，但雄黄毒副作用较大，临床应用受到限制。

　　２０世纪９０年代，砷制剂在肿瘤中的疗效重新引起人们的注意，寻找高效低毒的砷制剂成为肿瘤研究的一个方向。本研究制备了３种粒径的雄黄，对其进行了粒度和外型的观察，并通过细胞培养和体内移植肿瘤的方法，研究雄黄体内外的抑瘤作用，探讨降低粒径对雄黄的抑瘤活性是否有提高作用。

　　１材料与方法

　　１．１瘤种与实验动物

　　肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１由南京八一医院肝癌研究所提供，Ｈｅｐ肿瘤腹水小鼠购自南京市肿瘤医院。雄性ＩＣＲ小鼠６０只，体质量（２０±２）ｇ，等级ＳＰＦ，供货单位：北京维通利华实验动物有限公司。合格证号：ＳＣＸＫＳ（京）２０１２－０００１。南京中医药大学实验动物中心许可证号：ＳＹＸＫ（苏）２０１２－００４２。

　　１．２药物与试剂

　　雄黄购于江苏省药材公司，经南京中医药大学中药鉴定教研室鉴定为硫化物类矿物药雄黄族雄黄（Ｒｅａｌｇａｒ）。亚砷酸注射液（Ａｓ２Ｏ３）为哈尔滨伊达药业有限公司生产，批号：２０１２０８０１，浓度为１ｇ／Ｌ，使用时稀释１０倍。ＲＰＭＩ１６４０培养液和０．２５％胰蛋白酶购自美国ＭＥＲＣＫ公司，四甲基氮唑盐（ＭＴＴ）购自瑞士ＦＬＵＫＡ公司，二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）购自美国ＭＥＲ－ＣＫ公司。

　　１．３仪器设备

　　ＺＨＷＹ－１型气流粉碎机购自江阴市宏达粉体设备有限公司，Ｍ－１１０ＥＨ型微射流制粒机购自上海鲤跃精密机 械 贸 易 有 限 公 司，ＭＡＬＶＥＲＮ　ＭＡＳＴＥＲＳＩ－ＺＥＲ激 光粒度测试仪购自英 国ＭＡＬＶＥＲＮ公 司，ＮＡＰＣＯ６５００培养箱购自美国ＮＡＰＣＯ公司，ＩＸ５１Ｏ－ｌｙｍｐｕｓ倒置显微镜和ＳＺＸ７体视镜购自日本Ｏｌｙｍ－ｐｕｓ公司，ＤＧ３０２２Ａ型酶联免疫检测仪购自南京华东电子集团医疗装备有限责任公司，北航Ｃｍｉａｓ９８Ａ图象分析系统购自北京航空航天大学，Ｘ－６５０扫描电子显微镜购自日立公司，Ｄ／ＭＡＸ－ｒＡ　Ｘ射线衍射仪购自日本理学制作所。

　　１．４方法

　　１．４．１雄黄药品的制备 １）水飞雄黄（Ⅰ）：按药典方法制备。２）气流粉碎雄黄（Ⅱ）：以ＺＨＷＹ－１型气流粉碎机制备，气压为１．０ ＭＰａ，进样速度约０．２ｍＬ／ｓ。３）微射流雄黄（Ⅲ）：以Ｍ－１１０ＥＨ型微射流制粒机制备，２５　０００ｐｓｉ，１０ｐａｓｓ，最后１次５　０００ｐｓｉ，得到微射流雄黄样品。

　　１．４．２粒径测定 雄黄以水混旋，超声分散，ＭＡＬＶ－ＥＲＮ　ＭＡＳＴＥＲＳＩＺＥＲ激光粒度测试仪测定粒径。

　　１．４．３雄黄颗粒的电子显微镜测定条件 加速电压２０ｋＶ，喷金，纯铝样品托。

　　１．４．４雄黄颗粒的Ｘ射线衍射测定 Ｃｕ靶，管压４０ｋＶ，管流１５０ ｍＡ，扫描角度１０°～８０°，扫描速度１０°／ｍｉｎ，狭缝系统１、１、０．３和０．３。

　　１．４．５细胞形态观察 ＲＰＭＩ１６４０完全培养液培养ＳＭＭＣ７７２１细胞，加入浓度为２２．５ｍｇ／Ｌ的不同粒径的雄黄，２４ｈ后观察细胞生长状况。

　　１．４．６细 胞 增 殖 力 测 定 将１００μＬ（１～５）×１０５ｍＬ－１ＳＭＭＣ７７２１细 胞 植 入９６孔 培 养 板 内（１００μＬ／孔），待细胞贴壁后加入不同粒径的药物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ１０μＬ，使得雄黄终浓度为２２．５ｍｇ／Ｌ，重复１０孔。培养１２ｈ后ＭＴＴ法测定４９０ｎｍ处的吸光度（Ａ）值。

　　增殖抑制率（％）＝阴性对照组Ａ值－用药组Ａ值╱阴性对照组Ａ值

    １．４．７对动物接种移植瘤的抑瘤作用 无菌条件下抽出肿瘤小鼠的腹水，１∶４生理盐水稀释。分别给６０只雄性ＩＣＲ小鼠右前肢腋下接种０．２ｍＬ稀释后的腹水液，３ｄ后１５只一组随机分为４组。其中３组每日分别以３种粒径的雄黄灌胃０．３ｍＬ（２．２５ｇ／ｋｇ），另１组每日灌以生理盐水０．３ｍＬ作为对照。连续灌胃１０ｄ，最后一次灌胃后２４ｈ处死，剥取瘤块，称质量后以ＨＥ染色法染色，光镜下观察，图像分析仪统计分析。

　　１．５统计学方法

　　采用ＳＰＳＳ　１５．０进行统计学分析。计量资料用ｘ－±ｓ表示，数据符合正态分布，方差齐，多组间均数比较用单因素方差分析，多组间两两比较采用ＬＳＤ法。检验水准α＝０．０５。

　　２结果

　　２．１粒径与粒度分布

　　在累积百分率曲线上占颗粒总量为１０％、５０％和９０％所对应的粒子直径表示为ｄ１０、ｄ５０和ｄ９０，粒度分布用分布宽度（ＳＰＡＮ）表示。ＳＰＡＮ＝（ｄ９０－ｄ１０）／ｄ５０。３种雄黄颗粒的粒度和粒度分布数据见表１。

　　

　　２．２电子显微镜测定结果

　　如图１所示，水飞样品表面粗糙，有较多的尖锐角，但分散度较好；气流粉碎特别是微射流的样品粒度小，均匀性好，表面圆滑，颗粒的球性度提高。

　　

　　２．３　Ｘ射线衍射测定

　　从Ｘ射线衍射图谱可以看出，微射流雄黄样品的衍射峰宽明显加大，说明其晶体粒度减小（图２）。根据公式∈＝λ／（βＣＯＳθ），计算３个样品的平均晶粒度分别为３８．２９、２６．８８和１４．６５ｎｍ，说明超细化不仅能减小雄黄的颗粒度，而且对其晶粒度也有影响，使其呈现降低的趋势。

　　２．４肿瘤细胞形态

　　加入雄黄前后ＳＭＭＣ７７２１细胞的形态见图３。细胞与雄黄一起培养后，出现凋亡现象。特别是微射流组的肿瘤细胞，更早、更明显地出现凋亡特征。

　　２．５　ＭＴＴ测定结果

　　水飞组、气流组、微射流组和对照组经正态性检验，均服从正态分布（Ｐ＞０．０５），经Ｌｅｖｅｎｅ　ｔｅｓｔ也满足方差齐条件（Ｐ＞０．０５），因此采用方差分析。分析结果 表 明，多 组 间 比 较 差 异 有 统 计 学 意 义，Ｆ ＝４３０．９００，Ｐ＜０．００１。水飞组、气流组、微射流组和对照组Ａ值 分 别 为０．４０２±０．０３６、０．２７８±０．０２４、０．１８３±０．０２１和０．６３４±０．０３６，与对照组比较Ａ值均显着降低（Ｐ＜０．００１），说明雄黄对ＳＭＭＣ７７２１肝癌细胞的生长有抑制作用。水飞组、气流组和微射流组增殖抑制率分别为３６．６％、５６．２％和７１．１％，差异有统计学意义（Ｐ＜０．００１），说明随着粒度的降低，雄黄对ＳＭＭＣ７７２１肝癌细胞的抑制作用增强。

　　２．６在体抑瘤效果

　　对照组、水飞组、气流组和微射流组小鼠的瘤块质量分别为（０．６３４　７±０．２０８　５）、（０．４２５　８±０．２３０　８）、（０．３４８　２±０．１５３　１）和（０．３０７　７±０．１１６　８）ｇ，差异有统计学意义，Ｆ＝３．７６，Ｐ＝０．０２８；４组小鼠的瘤块坏死率分别为（１８．０±６．５）％、（２５．５±１９．８）％、（３２．７±１２．４）％和（３７．２±１１．８）％，差异也有统计学意义，Ｆ＝２．９４，Ｐ＝０．０４１。说明与对照组相比，雄黄可降低小鼠肿瘤的质量和坏死面积，且差异有统计学意义。

　　

　　３讨论

　　雄黄在抗肿瘤方面的作用逐渐引起人们的关注，但由于其不易溶于水，所以很难被人体吸收，生物利用度低，且临床用药量大，患者依从性差。有研究显示，口服过量雄黄精粉引起人急性砷化物中毒［３］。此外，有研究证实雄黄能致体内外细胞染色体畸变，具有遗传毒性［４］。孕兔服用雄黄后表现出明显临床毒性反应，活胎率下降，晚期胚胎流失率上升，具生殖毒性［５］，长期服用，还可产生蓄积毒性。这些毒副作用极大地限制了雄黄在临床上的进一步应用。随着纳米技术在医学中的飞速发展，纳米药物以新奇、显着、独特的疗效在医药行业中获得广泛应用，纳米雄黄也以其高生物利用度和低毒副作用备受关注［６］。

　　采用物理或化学方法制备纳米雄黄，可提高雄黄的溶解度和生物利用度，降低其毒副作用［７］。有研究表明，不同粒径的雄黄体外抑菌效果与粉体粒径大小呈负相关［８］，且诱导肿瘤细胞凋亡及毒副作用上具有尺寸效应，即纳米颗粒越小，作用效果越强［９］。近年来，纳米雄黄抗肿瘤的体外研究比较广泛。齐元富等［１０］发现纳米雄黄可抑制人皮肤鳞状细胞癌Ａ４３１细胞株增殖和新生血管的生成，且随剂量增加效果增强。

　　其机制可能与纳米雄黄上调色素上皮源性因子的表达和下调血管内皮生长因子的表达有关［１１］。纳米雄黄对宫 颈 癌 细 胞 株 增 殖 有 抑 制 作 用，且 能 诱 导 其 凋亡［１２－１３］。此外，还有研究发现纳米雄黄可诱导耐药性白血病细胞和肺癌Ａ５４９细胞凋亡［１４－１５］，并能显着诱导白血病干细胞发生凋亡［１６－１７］，这对阐明雄黄抗肿瘤的机制有很大的指导作用。

　　虽然纳米雄黄抑制肿瘤的研究已有很多报道，但基本局限于体外细胞实验，体内抗瘤研究少见。因此，本研究在体外研究的基础上，对纳米雄黄体内抑瘤效应进 行 了 比 较。 本 实 验 发 现，雄 黄 作 用 于 肝 癌ＳＭＭＣ７７２１细胞后，细胞出现了凋亡形态，细胞体积缩小，胞质固缩。随着粒度的降低，凋亡小体数量增加，雄黄颗粒越小，对ＳＭＭＣ７７２１细胞的抑制作用越强。此外，雄黄还能抑制ＩＣＲ小鼠的移植瘤生长，同时也呈现出粒度效应。本研究结果说明，提高雄黄的制粒水平，降低雄黄粒径，在保证抗肿瘤疗效的前提下可以通过降低雄黄制剂的粒径来达到降低雄黄毒性的效果，尤其有意义的是，小鼠的在体移植瘤实验结果也充分证明了这一点。

　　值得注意的是，在制备纳米化雄黄的过程中，纳米微粒极易聚合为大颗粒而减弱雄黄的作用，因为雄黄到达纳米级后极易发生团聚，不易使用，且表面积增加，容易氧化成Ａｓ２Ｏ３导致毒性增加。为解决这一问题，本研究在制备微射流雄黄的过程中加入了分散剂以降低颗粒的聚合作用。有研究者通过固体分散体技术来增加纳米雄黄的稳定性，不仅使纳米微粒的聚合作用下降，还提高了雄黄的抗氧化性，毒性也得到降低［１８］。这一技术有望在雄黄纳米化的应用中得到进一步的提高。

　　参考文献

　　［１］　国家药典委员会．中华人民共和国药典２０１０年版一部［Ｓ］．北京：中国医药科技出版社，２０１０：３１６．

　　［２］　周霭祥，姚宝森，郑金福．青黄散治疗慢性粒细胞白血病２５例近期疗效观察［Ｊ］．中国中西医结合杂志，１９８１，１（１）：１６－１９．

　　［３］　李跃维，邱诗宝，梁小滨，等．口服过量雄黄精粉引起急性砷化物中毒１例报告［Ｊ］．当代医学，２０１３，１９（３５）：４９．

　　［４］　赵源，吴文斌，汤家铭．雄黄致体内外染色体畸变［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２０１２，１８（１４）：２４５－２４９．