通心络胶囊对糖尿病视网膜组织LN、FN表达的影响

　　糖尿病视网膜病变 ( diabetic retinopathy，DＲ) 目前是主要的致盲原因之一［1］，也是糖尿病最为常见和严重的微血管并发症之一。糖尿病视网膜病变基本的病理改变为毛细血管内皮细胞增生、基底膜增厚、内皮细胞损伤、通透性增加、新生血管形成和纤维组织化［2］。基底膜为细胞外基质的存在方式之一，层粘连蛋白( LN) 和纤维粘连蛋白( FN) 是细胞外基质( ECM)的主要成分，其主要功能是介导细胞间的黏附、增殖、迁移及分化等过程［3］。本实验应用 KK/Upj-Ay 自发性 2 型糖尿病小鼠模型，观察通心络胶囊对糖尿病视网膜组织 LN、FN 表达的影响，进一步探讨糖尿病视网膜病变的发病机制。

　　1 材料与方法

　　1． 1 实验动物 SPF 清洁级 KK / Upj-Ay 糖尿病小鼠40 只，体重 30 ～ 40 g; SPF 清洁级 C57BL /6 小鼠，体重25 ～ 30 g，均为雄性，12 周龄，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号: SCXK-( 京) 2009-0002。

　　1． 2 药品与试剂 通心络胶囊购于石家庄以岭药业股份有限公司，层粘连蛋白( FN) 、纤维粘连蛋白( LN) 抗体均购于 abcam 公司。

　　1． 3 实验分组与给药 KK / Upj-Ay 小鼠按空腹血糖值( FBG) 随机分为模型组、通心络高剂量组、通心络中剂量组、通心络低剂量组，对照组使用 C57BL/6 小鼠，每组均为 10 只。通心络高、中、低剂量组分别给予生药量 4、2、1 g/kg 的通心络胶囊，对照组和模型组分别给予等体积的蒸馏水，每组均采用灌胃途径给药，1 次 / d，连续给药 3 个月。

　　1． 4 Ｒeal Time PCＲ( qPCＲ) 方法测定 FN、LN mＲNA的表达 取小鼠眼球，仔细分离视网膜组织，常规方法提取 ＲNA，进行 qPCＲ 扩增，以 GAPDH 作为内参照。GAPDH 引物: 上游 5 '-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3‘，下游 5'-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3’，产物片段143 bp; FN 引物: 上游 5 '-GGAGAACCAGGAGAGCA-CAC-3 ‘，下游 5 '-CACAAACTGTAGGTCCGTCG-3 ’，产物片段 97 bp; LN 引物: 上游 5'-AAGGGCTTTGGGATGT-CAT-3‘，下游 5 '-CGAGTCCAGTTCAGCGTGA-3 ’，产物片段88 bp; 实验结果与对照组进行比较后的相对值记为最终结果，对照组设置为 1。

　　1． 5 Western blot 法检测 FN、LN 蛋白的表达 取视网膜组织，低温储存，常规方法提取蛋白质，化学发光法显色，对条带进行吸光度积分扫描。GAPDH 作为内参照。用目的蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行比较。

　　1． 6 统计学分析 应用 SPSS 17． 0 统计软件，计量资料以 x珋 ± s 表示，采用单因素方差分析，两两比较应用S-N-K 法，P ＜ 0． 05 为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2． 1 视网膜 FN、LN mＲNA 表达变化 与对照组比较，模型组小鼠视网膜组织 LN mＲNA 表达明显增高( P ＜0． 05) ; 通心络低、中、高各剂量组 LN mＲNA 表达水平均较模型组明显下降( P ＜0． 05) ，随着剂量的增加 LN 的表达逐渐下降，各组之间互相比较差异均具有显着性( P ＜0． 05) 。与对照组相比，模型组小鼠视网膜组织 FN mＲNA 表达明显升高( P ＜ 0． 05) ; 而低、中、高剂量组 FN mＲNA 表达水平均较模型组明显降低( P ＜0． 05) ，而高剂量组较中、低剂量组的表达下调更为明显( P ＜0． 05) 。见表 1。【1】

　　
　　2． 2 视网膜 FN、LN 蛋白的表达变化 Western blot结果显示模型组小鼠视网膜 FN、LN 蛋白表达均明显高于对照组( P ＜ 0． 05) ; 与模型组比较，通心络各剂量组 FN、LN 蛋白表达均显着下降( P ＜0． 05) 。见表2，图 1。【2】

　　3 讨论

　　DＲ 是一种世界性的致盲眼病，是糖尿病患者的主要并发症之一，高血糖是 DＲ 视网膜损伤的重要始发因素［4］。持续性的高血糖状态可以诱发包括蛋白激酶 C 激活、氧化应激、氨基己糖通路活性增高等一系列代谢异常，诱发一系列复杂的级联反应造成视网膜循环障碍［5］，使周围毛细血管内皮细胞失去调节能力，毛细血管内皮细胞的基底膜增厚，进而造成毛细血管的阻塞引起周围组织缺血水肿，伴微血栓形成甚至血管闭塞［6］。视网膜微血管闭塞性改变，属中医“络病”范畴，临床用药清除瘀血，通其血脉，偏重治络，药物选择应在整体辨证的基础上，加上辛味药和虫类药的应用，以达到扶正及祛邪通络的目的［7］。通心络是一种由人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕、赤芍等组成的中药复方制剂; 有研究表明，其可改善糖尿病患者视网膜微循环，减轻视网膜及黄斑水肿，疗效确切［8］。随着对细胞外基质( ECM) 的分子结构和功能的研究，发现 ECM 在 DＲ 发生中具有重要的作用，已引起中外学者的关注［9］。FN、LN 是 ECM 大家族中的重要成员，是构成基底膜的主要成分，FN 可以与细胞外基质各类成分相结合，并促进细胞外基质其他成分的沉积; LN 则可以引起细胞黏附并影响基底膜的电荷选择性，导致毛细血管通透性改变，加重视网膜损伤［10］。

　　因此，FN、LN 作为细胞与间质相互作用的桥梁，在 DＲ的发生发展中起着重要作用。

　　本实验观察通络药物通心络胶囊对自发性 2 型糖尿病小鼠( KK/Upj-Ay 小鼠) 视网膜病变的影响。结果显示模型组小鼠视网膜组织 FN、LN 的表达与对照组比较显着升高( P ＜ 0． 05) ，给予通心络灌胃治疗后，通心络高、中、低剂量组小鼠视网膜组织 FN、LN 的表达明显减少( P ＜0． 05) ，提示通心络胶囊可通过抑制糖尿病小鼠视网膜组织 FN、LN 的合成，缓解糖尿病视网膜病变，为中医治疗 DＲ 提供了理论依据。
　　
　　参考文献
　　
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　　4 Choudhuri S，Dutta D，Sen A，et al． Ｒole of N-? -carboxy methyl lysine，advanced glycation end products and reactive oxygen species for thedevelopment of nonproliferative and proliferative retinopathy in type 2 di-abetes mellitus． Mol Vis，2013，19: 100-113．
　　5 陈霞琳，汪迎，张凯，等． 糖尿病性视网膜病变相关危险因素分析． 临床眼科杂志，2013，21: 320-322．
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　　7 郭承伟，张宏国，马栋． 从络论治糖尿病视网膜病变的理论与应用探讨． 中国中医眼科杂志，2011，21: 255-257．
　　8 孟宪民，张书申，段永畅． 通心络胶囊联合激光治疗糖尿病性视网膜病变的观察． 医药论坛杂志，2011，32: 155-156．
　　9 Kowluru ＲA，Tang J，Kern TS． Abnormalities of retinal metabolism in dia-betes and experimental galactosemia． VII． Effect of long-term administra-tion of antioxidants on the development of retinopathy． Diabetes，2001，50: 1938-1942．
　　10 苑维，金明，潘琳，等． 红参对糖尿病大鼠视网膜微血管病变细胞外基质的影响． 中国中医眼科杂志，2004，14: 200-203．