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银杏叶药材中银杏酸含量的高效液相法测定

来源:学术堂 作者:周老师
发布于:2015-04-07 共2441字
论文摘要

  银杏酚酸广泛存在于银杏的根、梗、叶、果和外种皮中,它可看作是 6 - 烷基或 6 - 烯基水杨酸的衍生物,根据侧链碳原子数目及单双键的不同主要有白果新酸( C13∶ 0) 、白果酸( C15∶ 1) 、十七烷二烯银杏酸( C17∶ 2) 、氢化白果酸( C15∶ 0) 、十七烷一烯银杏酸( C17∶ 1) 等 5 种[1]。研究表明,银杏酚酸具有生物学毒性,有抗炎、抗过敏、抑菌及防治病虫害等作用[2],是当前国际上治疗心脑血管疾病药物。国际上规定,银杏叶提取物中银杏酚酸的含量必须低于 5 μg/g。因此,建立准确的银杏酸分析方法显得尤其重要。银杏酚酸的分析一般用高效液相色谱法[3]和高效液相—质谱联用法[4],也有用分光光度计分析的报道[5]。本实验采用简单的预处理方法,建立了银杏叶药材中所含有的全部银杏酸的HPLC 测定方法,为银杏叶提取物及其制剂的质量监控和安全性评价提供参考。

  1 仪器与试药

  1. 1 仪 器

  美国 Agilent1100 高 效 液 相 色 谱 仪、超 声 波 清 洗 机( HS20500D) 、天平( AB204 - S) 。

  1. 2 试 药

  白果新酸对照品( 中国生物制品鉴定所,批号: 110713 -200609) ,总银杏酸对照品 ( 中国生物制品鉴定所,批号:110713 - 200609) ,甲醇为色谱纯,冰醋酸为分析纯,水为娃哈哈纯净水( 杭州娃哈哈集团有限公司) 。

  2 色谱条件

  Pntulips BP - C18 ( 4. 6 × 250 mm,5 μm) 柱,检测波长:310 nm,流动相: 甲醇—1% 冰醋酸 ( 95: 5) ,流速: 1. 0 ml /min,柱温: 30℃ 。理论板数按白果新酸峰计算应不低于4000。

  3 线性关系考察及检测限、定量限

  3. 1 标准溶液的制备

  分别称取白果新酸、总银杏酸对照品适量,加甲醇溶液分别制成 0. 426 mg/ml、0. 292 mg/ml 的白果新酸、总银杏酸的对照品溶液。

  3. 2 标准曲线的绘制

  分别精密吸取白果新酸对照品溶液 0. 4、0. 9、1. 4、1. 9、2. 4 μl 注入高效液相色谱仪,测定峰面积值,以峰面积( A)对进样量( C) ,进行线性回归,得白果新酸性回归方程: y =475634x + 1. 425,r2= 0. 9999,线性范围 0. 1704 ~ 1. 0224 μg。

  分别精密吸取总银杏酸对照品2、4、6、8、10 μl 注入高效液相色谱仪,测定峰面积值,以峰面积( A) 对进样量( C) ,进行线性回归,得总银杏酸线性回归方程: y = 376918x + 7. 86,r2=0. 9996,线性范围 0. 584 ~ 2. 92 μg。说明在此线性范围内峰面积与进样量呈良好的线性关系。结果见表 1、表 2。

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  3. 3 检测限和定量限

  以白果新酸测定检测限和定量限。结果检测限( 信噪比3∶ 1) : 检测浓度为 0. 0006 mg / ml; 定量限( 信噪比 10∶ 1) :检测浓度为 0. 0020 mg/ml。

  4 样品溶液的制备

  4. 1 测定白果新酸供试品溶液的制备

  精密称取银杏叶药材 2 g,精密加入石油醚( 60 ~ 90℃)50 ml,称重,回流提取 1. 5 h,放冷,再称重,补足减失重量,过滤。精密吸取滤液 25 ml,回收溶剂至干,分次加入 10 ml甲醇,超声至残渣溶解,过滤,移至 10 ml 容量瓶中,过微孔滤膜滤过,即得。

  4. 2 测定总银杏酸供试品溶液的制备

  精密称取银杏叶药材 0. 5 g,精密加入石油醚( 60 ~90℃ ) 20 ml,称重,回流提取 1. 5 h,放冷,再称重,补足减失重量,过滤。精密吸取滤液 10 ml,回收溶剂至干,分次加入5 ml 甲醇,超声至残渣溶解,过滤,移至 5 ml 容量瓶中,过微孔滤膜滤过,即得。

  5 方法学考察

  5. 1 精密度试验

  取测定白果新酸供试品溶液( 贵州三号) ,精密吸取 3μl,连续进样 6 次,测定相应峰面积。取测定总银杏酸供试品溶液( 贵州六号) ,精密吸取2 μl,连续进样6 次,测定相应峰面积。白果新酸 RSD% 为 0. 45%,总银杏酸 RSD% 为0. 66% ,结果表明精密度良好。结果见表 3、表 4。

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  5. 2 稳定性试验

  精密吸取测定白果新酸供试品溶液( 贵州三号) 、测定总银杏酸供试品溶液( 贵州六号) 3、2 μl,按照“2”项下所述的色谱条件,分别于 0、2、4、6、8、12 h 测定,白果新酸 RSD =0. 47% ,总银杏酸 RSD = 0. 94% ,说明各供试品溶液在 12h内稳定。结果见表 5、表 6。

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  5. 3 重复性试验

  按“4. 1”项下所述的方法平行处理 6 次,分别精密吸取测定白果新酸供试品溶液( 贵州三号) 、测定总银杏酸供试品溶液( 贵州六号) 3、2 μl,同法测定白果新酸、总银杏酸,白果新酸 RSD =2. 35%,总银杏酸 RSD = 2. 39%,说明供试品溶液的重复性良好。其结果见表 7、表 8。

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  5. 4 回收率试验

  精密称取已知含量的银杏叶各 6 份,分别加入各对照品,照供试品溶液制备项下的方法处理,测定各成分的峰面积,计算回收率,结果见表 9、表 10。

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  6 样品含量测定

  分别精密称取银杏叶药材,照供试品溶液制备项下的方法处理进样测定,用外标法计算银杏叶中白果新酸和总银杏酸的含量。银杏叶中白果新酸和总银杏酸的含量以 5 次测得的平均值计,结果见表 11。

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  7 讨 论

  10 个样品测定结果表明,由于产地的差异,银杏叶药材中银杏酸含量有很大差别。为控制银杏叶药材的质量,保障临床应用的安全性,对银杏酸进行限量检查有重要意义。

  银杏叶中银杏酚酸以 C13 ~ C17 银杏酚酸的形式存在,结构上具有相似性和规律性,分别为白果新酸、白果酸、十七烷二烯银杏酸、氢化白果酸、十七烷一烯银杏酸。

  实验选择的流动相系统有: ① 甲醇—1% 冰醋酸( 95∶5) ; ② 甲醇—3% 冰醋酸( 85∶ 15) ; ③ 甲醇—1% 冰醋酸( 90∶ 10) ; ④ 乙腈—1% 冰醋酸( 90 ∶ 10) 。结果表明,甲醇—1% 冰醋酸( 95∶ 5) 在液相色谱中 5 个峰的分离度较好。

  参考文献:

  [1] 田亚平,尤文元,李 娜. 荧光分析法测定银杏酚酸[J]. 分析化学,2006,34( 研究简报特刊) :S155 -S157.

  [2] 倪学文,吴谋成. 银杏酚酸的分离鉴定及其抗菌活性研究[J]. 食品科学,2004,25(9) : 59 -63.

  [3] 仰榴青,吴向阳,陈 钧. 高效液相色谱法测定银杏外种皮中银杏酸的含量[J]. 分析化学,2002,30(8) : 901 -905.

  [4] 邓永智,袁东星,陈 猛,等. 正己烷萃取 - HPLC - MS 联用测定中成药银杏浸膏中微量烷基酚酸含量[J]. 食品科学,2003,24(12) : 107 -110.

  [5] 仰榴青,吴向阳,陈 钧,等. 银杏酸的分光光度法测定[J]. 分析化学,2004,32(5) : 661 -664.

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