杆菌肽在水产品中残留量测定的微生物方法(2)

　　2.2杆菌肽的最低检测限

　　表1为各组织添加药物量分别为0.125、0.250、0.375、0.500μg/g下的抑菌圈直径，其中草鱼肌肉中添加量为0.250μg/g时可见清晰抑菌圈，直径（11.69±0.60）mm,对虾和鳗鲡肌肉中添加量为0.500μg/g可见清晰抑菌圈，直径分别为（10.60±0.60）mm和（10.17±0.73）mm,空白样品及添加量为0.125μg/g的各样品均未见抑菌圈（直径小于10mm）。相比于空白样品存在显着性差异。因此，草鱼肌肉中最低检测限为250μg/kg,对虾和鳗鲡肌肉中最低检测限为500μg/kg.

　　2.3杆菌肽的添加回收率

　　杆菌肽在水产品可食性组织中添加回收率及其变异系数见表2.重复测定3次，不同水产品肌肉组织添加量在0.5~2.5μg/g时，草鱼肌肉回收率为86.82%~92.56%,变异系数为2.32%~10.77%;对虾肌肉回收率为81.61%~92.17%,变异系数为2.02%~11.80%;鳗鲡肌肉回收率为70.45%~93.44%,变异系数为4.48%~12.62%.各组织的回收率均在标准要求的范围（70%~120%）。变异系数均小于15%,符合该方法的检测要求。

　　2.4杆菌肽的特异性不同类别药物对3种细菌的抑菌效果测定结果见表3.在一定范围内，只对藤黄微球菌敏感的药物是杆菌肽，而其他药物或者对藤黄微球菌不敏感，或者对大肠杆菌和枯草芽胞杆菌敏感。利用不同药物在3种细菌检测平板中的抑菌效果可以排除所检测的药物是否为杆菌肽。

　　3讨论

　　杆菌肽抗菌谱广，目前被广泛应用于饲料添加剂预防和治疗疾病，但是由于使用不科学，药物在产品中残留很多，食用后给人体健康带来严重影响。

　　欧盟规定了杆菌肽残留检测物为杆菌肽A、B和C3种组分之和，牛奶中杆菌肽的残留限量为100μg/kg.中国和美国均规定，动物性食品猪、牛和牛奶、禽和禽蛋等可食组织中杆菌肽的最高残留限量为500μg/kg,残留检测的标示物为杆菌肽A、B和C三者之和[14].在测定杆菌肽残留量的方法中，色谱和液质联用技术虽然检测结果比较准确，但检测药物必须准确知道药物的组分及其分子结构，而杆菌肽的提取纯化目前还很难做到，各批次的药物组分有一定的差别，所以难以应用该方法进行残留量检测。且色谱和液质联用技术仅测定了杆菌肽A或者B,且前处理复杂，仪器昂贵，对另几种含量较少的组分均未测定[9-11,13].相较于其他方法，微生物法则是一种经典的抗菌药物残留检测方法[15-16],操作简单，不需要昂贵的仪器，适合生产应用，且能够有效检测到这一类药物（具有生物活性的多肽类）残留的每种组分的活性总量。所以微生物学测定动物性食品中杆菌肽残留的方法仍被广泛应用[8-9,15].

　　根据药物对某些特异微生物的杀灭或抑制效果，来定量或定性确定样品中残留的药物，方法科学有效。

　　在对检测菌种的筛选上，通过比浊法和杯碟法研究了藤黄微球菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌3种菌对杆菌肽的敏感性，最后发现藤黄微球菌对杆菌肽最敏感。与此同时，利用药物对不同细菌具有不同的敏感性的特性，用其他微生物制作的多平板法检测[17],确定了单一组分的残留物为杆菌肽。中国兽药典中有抗菌药物的微生物检定试验，其中试验设计表规定藤黄微球菌（CMCC28001）在pH值为6.5~6.6的培养基中，对杆菌肽、金霉素、多西环素等抗菌药物的灵敏度最高。而枯草芽胞杆菌（CM-CC 63501）在pH值为7.8~8.0培养基内，对盐霉素和吉他霉素等抗菌药物的灵敏度最高[18].本试验在一定浓度下，杆菌肽对藤黄微球菌最敏感，其他细菌不敏感。而其他药物也具有类似敏感细菌的情况。通过筛选，确定了藤黄微球菌、大肠杆菌和枯草芽胞杆菌这3种细菌的不同组合。参照不同药物对3种细菌的抑菌情况，分析不同药物对不同细菌能否产生有效抑菌圈（10~25mm），发现制作的三检定平板可以有效鉴定出单一残留物是否为杆菌肽。

　　在对3种基质的标准曲线和PBS的标准曲线的比较中发现，每种肌肉对杆菌肽的抑菌效果都有不同的影响，影响由大到小依次为鳗鲡、草鱼、对虾。由3种基质的营养成分可以发现，鳗鲡的粗脂肪含量最高，草鱼、对虾很低，这与杆菌肽的在各基质中的回收率也相吻合，可见不同肌肉中脂肪含量的高低会影响药物残留的检测结果，脂肪含量越高，检测回收越困难。

　　测定杆菌肽在动物性组织中的残留情况，其中样品前处理的方法很重要。目前，常用于生物样品中提取杆菌肽残留的提取溶剂很多，如甲醇/甲酸[13,19]、乙腈/三氯乙酸[12]、甲醇/偏磷酸[20]等。其中我国曾颁布的出口禽肉中杆菌肽残留量检验方法中，采用了吡啶来提取冻鸡肌肉组织中杆菌肽的残留[8].本研究比较上述提取溶剂的提取效果，发现甲醇/甲酸水提取效果较好。通过对甲醇、乙腈和丙酮3种单一提取剂在水产品各肌肉组织中杆菌肽残留的研究，发现丙酮提取效果优于其他2种。但丙酮在提取后溶液含水和杂质多，氮吹浓缩中需要时间过长，最终选择甲醇/甲酸水溶液，通过旋蒸浓缩，效果理想。提取后经正己烷脱脂，可去除大部分杂质，药物复溶后过0.22μm滤膜，终试液澄清，抑菌圈清晰。

　　最终结果显示，杆菌肽在各肌肉组织空白提取液1~10μg/mL范围内，药物质量浓度对数与抑菌圈的直径线性关系良好（R2>0.990 0），平均回收率70.45%~93.44%,变异系数2.02%~12.62%.

　　测定低限草鱼肌肉为0.25μg/g,对虾和鳗鲡肌肉为0.50μg/g,总体达到或低于我国农业部颁布的残留限量的国家标准。杆菌肽残留物还可以通过三细菌检定平板确定。因此，本试验建立的对水产品可食性组织中杆菌肽残留量检测的微生物方法是可行的，能够满足我国水产品可食性组织（肌肉）中杆菌肽残留量检测的要求。

　　参考文献：
　　[1] 程美玲，高士争.几种新型安全抗生素类饲料添加剂[J].饲料世界，2001（10）:4-6.
　　[2] 陈杖榴.兽医药理学[M].3版.北京：中国农业出版社，2010:261.